[发明专利]树突状细胞子集CD103+DC的体外培养方法及鉴定方法

权利要求书

1.树突状细胞子集CD103⁺DC的体外培养方法，其特征在于，所述树突状细胞子集CD103⁺DC为小鼠骨髓源CD103⁺DC，体外培养方法包括以下步骤：

1)配制完全培养基：

完全培养基是由含有FLT3L、GM-CSF、FBS和双抗的RPMI-1640培养基配制而成，其中FLT3L的含量为200ng/mL，GM-CSF的含量为10ng/mL，FBS的含量按照质量百分比计为10％，双抗的含量按照质量百分比计为1％；

2)小鼠骨髓源细胞的培养：

取6-8周龄C57BL/6小鼠，脱颈处死，置于75％酒精中浸泡30min；用DPBS冲洗小鼠胫骨、腓骨腔以获得骨髓源细胞，获得的骨髓源细胞以离心力300g离心5min，弃上清；加入3倍体积的红细胞裂解液作用2min，以离心力300g离心5min，弃上清；加入DPBS悬浮细胞，用细胞筛过滤，滤液以离心力300g离心5min，弃上清；加入一定体积的完全培养基悬浮细胞，使细胞浓度最终为1.5×10⁷个/mL，并移至6孔板中培养；培养至第5d，每孔加入1/2体积的完全培养基，继续培养；于第9d收集细胞，以离心力300g离心5min；加入完全培养基重悬，继续培养至第15d，收获细胞。

2.根据权利要求1所述的树突状细胞子集CD103⁺DC的体外培养方法培养得到的小鼠骨髓源树突状细胞子集CD103⁺DC。

3.根据权利要求2所述的小鼠骨髓源树突状细胞子集CD103⁺DC的鉴定方法，其特征在于，是在骨髓源细胞培养至第15d时，分别进行喷晶扫描电镜观察和荧光显微镜观察；在骨髓源细胞培养至第16d时，进行流式细胞术鉴定。

4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述喷晶扫描电镜观察过程为：将培养至第15d的骨髓源细胞，加100ng/mL LPS处理24h；收集细胞至15mL离心管，以离心力300g离心5min；将细胞用完全培养基重悬，转入放置多聚赖氨酸包被无菌盖玻片的48孔细胞培养板中，培养24h后见部分细胞贴壁，弃去细胞悬液；用DPBS清洗3次，每次5min；2.5％的戊二醛4℃固定1h；弃去戊二醛，DPBS清洗3次；依次用30％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、100％的乙醇逐级脱水，自然干燥；取出盖玻片，喷晶扫描电镜观察。

5.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述荧光显微镜观察过程为：将培养至第15d的骨髓源细胞，加100ng/mL LPS处理24h；收集细胞至15mL离心管，以离心力300g离心5min；将细胞用完全培养基重悬，转入放置多聚赖氨酸包被无菌盖玻片的6孔细胞培养板中，培养24h后见部分细胞贴壁，弃去细胞悬液；用DPBS清洗3次，每次5min；4％多聚甲醛室温下固定20min，DPBS清洗3次；0.2％Triton-100通透15min，DPBS清洗3次；5％BSA于4℃下包被30min，DPBS清洗3次；按体积比1：100比例加入Anti-Mouse CD103一抗，37℃温箱孵育2h，DPBS清洗3次；按体积比1：100比例加入Antibody To Rabbit IgG(H+L)二抗，37℃温箱避光孵育1h，DPBS清洗3次；加入10μL DAPI，室温下孵育10min，DPBS清洗3次；取出盖玻片，用荧光淬灭剂封片；荧光显微镜观察。

6.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，流式细胞术鉴定过程为：收集培养至16d的骨髓源细胞至15mL离心管，以离心力300g离心5min，弃上清，DPBS清洗2次；用DPBS将细胞浓度调整至1×10⁶个/mL；分别取1mL细胞悬液转入2个1.5mL的EP管中，其中1管加入5μL的Anti-Mouse CD103-PE，另1管加入同型对照仓鼠IgG-PE，37℃避光孵育30min；以离心力300g离心5min；弃上清，DPBS清洗两次；分别加入500μLDPBS重悬细胞，过膜并转移至专用检测管，流式细胞仪检测。