[发明专利]一种非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于检测非小细胞肺癌的靶向诊断技术，特别是一种用于检测非小细胞肺癌的miRNA检测试剂盒及其应用。

背景技术

非小细胞肺癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率高居各癌症致死率之首。根据世界卫生组织报告，全球癌症死亡人数到2030年将超过1310万/年，全球每年死于非小细胞肺癌的患者达137万以上。非小细胞肺癌起病隐匿，大多在晚期才能被发现，其5年生存率约在15％左右。若能做到早期诊断，其生存率将被大大提高。

现有的临床诊断技术如X光、B超等无法做到在临床早期发现，而CT、MRI和PET等检查，可以发现更小的肿瘤组织，但其特异性低，仍需要病理活检的辅助才能明确诊断。纤支镜等内窥镜的使用可提高了非小细胞肺癌的诊断率，但均为介入性检查，对患者的损伤和痛苦大，且对操作者技术要求高，也并非肺内所有的部位都能取到活检，不适用于大规模的人群筛选普查。液体活检作为新型的检测手段，具有特异性高、无创、快捷等优点，是癌症检查发展的趋势与方向。

发明内容

本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种使用方便、快捷、特异性高、可作为非小细胞肺癌早期辅助诊断的miRNA检测试剂盒。

为此，本发明提供了一种非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒，其包括miR-146和miR-340联合使用作为非小细胞肺癌分子标记物。

此外，本发明还提供了一种非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒，其包括miR-146、miR-340和miR-U6，其中miR-U6作为内参。

此外，本发明还提供了一种非小细胞肺癌miRNA检测试剂盒，其包括荧光定量PCR反应体系、内参体系和逆转录反应体系。

在本发明的一个方面，所述荧光定量PCR反应体系中包括分别针对miR-146、miR-340的正向引物和反向通用引物。其中，针对所述miR-146的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对所述miR-340的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID ID No.5所示。所述荧光定量PCR反应体系的试剂包括：SYBR Green混合液、正向引物液、反向通用引物液和纯水。

所述内参体系包括内参miR-U6和针对miR-U6的正向引物、针对miR-U6的反向引物：针对miR-U6的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：针对miR-U6的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述反转录反应体系的试剂包括多聚腺苷酸聚合酶、反转录酶混合液、反转录缓冲液和无核酸酶双蒸水。

上述荧光定量PCR反应体系的总体积为20μL：所述荧光定量PCR反应体系中还包括DNA模板：其中，所述SYBR Green混合液的体积是10μL，所述正向引物液的体积是0.5μL，所述反向通用引物液的体积是0.5μL，所述DNA模板2μL，无核酸酶双蒸水7μL：所述正向引物液的使用浓度为2μM，所述反向通用引物液的使用浓度为2μM：所述DNA模板是所述反转录反应体系反应后的产物稀释10倍获得的。

上述反转录反应体系的总体积为20μL：所述反转录反应体系中还包括miRNA样品：其中，所述多聚腺苷酸聚合酶的体积是0.25μL，所述反转录酶混合液的体积是5μL，所述反转录缓冲液的体积是4.0μL，所述miRNA样品的加入量是1.0μg，其余是无核酸酶纯水：所述多聚腺苷酸聚合酶的使用浓度为40U/μL：所述miRNA样品中含有内参miR-U6。

在另一方面，本发明还提供了miR-146和miR340联合使用用于制备诊断非小细胞肺癌的试剂。

判断公式为：Y＝2.251×A_miR-340+1.706×B_miR-140-4.729

当Y>0.5时，可诊断为非小细胞肺癌。

本发明具有的积极效果：

(1)miR-146和miR-340作为组合的分子标记物，首次应用于上述miRNA非小细胞肺癌检测试剂盒的开发，实现了其在早期诊断非小细胞肺癌中的应用。

(2)本发明的miRNA检测试剂盒选择了特异性强、灵敏度高的miR-146和miR-340的miRNA标记物进行组合，开发成检测试剂盒，检测快速方便、准确率高，可满足临床快速早期诊断非小细胞肺癌的需求。