[发明专利]一株杀菌固氮荧光假单胞菌及其发酵方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株杀菌固氮荧光假单胞菌及其发酵方法与应用，尤其涉及其在生物防治中的应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

荧光假单胞菌(Pseudomonas protegens)是一种植物生防菌，能分泌多种活性物质，在抗细菌、真菌、土栖害虫幼虫等方面都具有一定效果，因此在植物病害防治中具有很大的开发前景，具有替代化学农药的潜质。

荧光假单胞菌CHA0(Pseudomonas protegens CHA0)分离自烟草根系，产生的次生代谢产物2，4-二乙酰基藤黄酚(2,4-diacetylphloroglu-cinol,2,4-DAPG)能够有效地防治 Gaeu-mannomyces graminis var.tritici引起的小麦全蚀病，Thielaviopsis basicola引起的烟草黑根腐病和Ralstonia solanacearum引起的番茄细菌性青枯病。retS基因是CHA0分泌的次生代谢产物2，4-DAPG及相关红色素合成负调控因子，因此为了获得一株杀菌活性更高、更有利于植物生长的菌株，使用生物工程手段对野生型Pseudomonas protegens CHA0进行了retS基因的敲除及固氮基因簇NiF的整入，最终获得杀菌固氮工程菌CHA0-△retS-NiF。

近年来，由于化肥的过量使用使土壤机制发生变化，土壤连作障碍、次生盐渍化、板结和酸化情况严重等的现状，极大地阻碍农作物的产量提高。其中化肥中的氮是植物不可缺少的营养元素，而大自然中氮输入的最主要途径为生物固氮，研究表明固氮微生物可以有效地为植物提供氮营养，供其吸收与利用，促进其生长。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一株具有杀菌和固氮能力的荧光假单胞菌突变菌株CHA0-△retS-NiF。

本发明还提供了上述菌株的发酵方法及其在生物防治中的应用。

本发明所提供的荧光假单胞菌(Pseudomonas protegens CHA0)突变菌株为 CHA0-△retS-NiF，其保藏编号为CGMCC No.14476，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期： 2017年7月31日。对其革兰氏染色为阴性菌株，细胞为杆状，菌落呈淡土黄色，菌落边缘缺刻，进行有氧呼吸，在KB培养基中生长状态最佳，28℃为其最适生长温度，通常，经过一段时间的KB培养后其发酵液为土黄色或者浅砖红色，且伴有大量泡沫产生；和野生型的CHA0细菌相比，突变菌株CHA0-△retS-NiF染色体上retS基因被敲除，同时插入了具有生物固氮功能的NiF基因岛；

荧光假单胞菌(Pseudomonas protegens CHA0)突变菌株CHA0-△retS-NiF的发酵培养方法，包括以下步骤：

(1)种子活化：从-80℃超低温冷冻存储箱中取出含有CHA0-△retS-NiF菌种的甘油管，待解冻后取少量菌液划线于LB+genta 20平板上，于30℃恒温生化培养箱中倒置培养20h，从平板上随机挑选5个单菌落进行菌落PCR验证以确保获得正确的目的菌株；

(2)摇瓶种子培养：将活化好的CHA0-△retS-NiF菌种接入KB培养基中，放置在全温振荡培养箱中培养20h，得到种子液；

(3)发酵罐培养：将种子液接种到装有KB培养基发酵罐中，接种量为5～10％(每 100mlKB培养基加入5～10ml种子液)，接种完毕后进行通气量，溶氧，温度，转速，pH设置，每隔6h取菌液测定细胞密度，发酵周期为96h。

作为优选的技术方案之一，步骤(2)与步骤(3)所述KB培养基的配方为：每1000mL 水中含甘油10mL，蛋白胨20g，K₂HPO₄ 1.5g，MgSO₄·7H₂O 1.5g。

作为优选的技术方案之一，步骤(2)中摇瓶种子的培养条件为30℃，200rpm。