[发明专利]一种用于银离子检测的DNA探针组及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于银离子检测领域，具体涉及一种用于银离子检测的DNA探针组。

背景技术

银离子广泛应用于摄影、影像、电器、医药等领域，但是超过一定浓度的银离子就对人体有一定的毒性，通过结合酶的非活性部位，能够抑制生物酶的活性甚至使生物酶丧失活性，破坏正常的生物化学反应，严重影响人类的健康和环境。银离子引起的这些问题使得非常有必要研究出快速、简便的方法检测银离子。传统检测银离子的方法有：电热原子光谱法、电位法、伏安法、电感耦合等离子体原子发射光谱法和荧光法等，但是存在费时、仪器昂贵、操作繁琐等缺点，大大限制了应用。因此，设计高灵敏、高选择性检测Ag⁺的生物传感器是非常有必要的。

随着纳米科技的兴起和发展，纳米材料由于独特的表面效应、微尺寸效应、量子效应和宏观量子隧道效应，其化学、电学、磁学、光学性质表现出常规材料所不具备的优越性能，引起各学科领域的专家和学者的广泛关注。近年来，作为一种优异的纳米材料，纳米金因其极佳的比表面积和生物兼容性被广泛应用在生物传感方面，将纳米金和生物传感方法相结合设计的新型纳米生物传感器也备受人们的关注。Feng把DNA功能化的金纳米当作光散射探针，利用胞嘧啶与银离子特异性结合的性质设计了一种简单，快速检测汞离子方法。但是，该方法引入了掩蔽剂来避免其它金属离子的干扰，这会对环境造成一定的污染。Lin课题组基于吐温-20稳定化的纳米金设计了一种同时检测汞离子和银离子的比色传感方法，但是此方法的灵敏度过低，检测限为100nmol⁻¹。本发明将基于荧光偏振技术设计了一种简单、方便、高选择性检测Ag⁺的金纳米粒子生物传感器，具有操作方便、成本低、选择性好、检测限低，无需掩蔽剂等优点。

发明内容

本发明的内容就是提供了一种基于Ag⁺诱导的荧光标记分子体积大小的变化来实现定量检测银离子的DNA探针组，并且实现了简单，快速，高选择性和高灵敏的特性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种用于银离子检测的DNA探针组的制备方法，包括以下步骤：

AuNPs的修饰：修饰前，Probe A需要用TCEP预先断键，即将Probe A浸泡在含有100mM TCEP的20 mM的MOPS-HCl缓冲溶液 (pH 7.4) 中至少2小时后才能使用。Probe A对Au NPs的修饰参照Mirkin课题组的方法。将Probe A与Au NPs于10 mM的MOPS-HCl缓冲溶液 (pH 7.4) 中反应24小时后，向混合溶液中滴加1 M NaCl/100 mM PBS (pH 7.4)使溶液中NaCl的最终浓度为0.1 M, 陈化40小时后，通过三次14,000 rpm高速离心将未修饰上的过量DNA除去。

本发明采用粒径为13 ±2 nm的金纳米粒子。当金纳米粒子尺寸过大时，其表面具有不稳定性，容易聚合沉降，使检测剂失效（图1为35nm的纳米金透射电镜图）；尺寸过小时，修饰在金纳米粒子表面的DNA又会包覆住金纳米，使得对汞离子检测的失效（图2为7nm的Au-DNA示意图）。因此我们采用粒径为13 ±2 nm的金纳米粒子。图3为粒径13±2 nm的金纳米粒子的透射电镜图，从图中可看出，金纳米粒子外形呈球形，粒度分布比较均匀，粒子之间可基本分开，说明制备出的金纳米粒子质量较好。在使用前，本发明所用到的玻璃器皿均需用新鲜配制的王水浸泡，自来水冲洗后再用二次水冲洗，放入烘箱中干燥备用。

金纳米粒子是由柠檬酸三钠还原HAuCl₄溶液制得，将100 mL质量分数为 0.01% 的氯金酸水溶液加入到连有冷凝管的圆底烧瓶中，剧烈搅拌下加热至沸腾，再快速加入3.5 mL 质量分数为1% 的柠檬酸三钠溶液，溶液由浅黄色变为酒红色后，继续恒温加热搅拌15分钟，最后关闭热源，搅拌至室温。所得金纳米粒子经纤维素膜过滤后，通过低温高速(14000 rpm)离心进行浓缩和纯化。

荧光偏振检测是基于荧光标记物质与大分子结合前后体积的变化，体积的变化引起分子运动速率变化，布朗运动时间也发生变化，产生的荧光偏振值也随之发生变化，从而达到对样品的定量检测。

荧光偏振值 (P) 的变化对荧光标记分子的旋转运动非常敏感，p通过Perrin方程：