[发明专利]胶质瘤诊断标志物Circ19:5604583|5604936及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及涉及一种用于胶质瘤诊断的血清circRNA标志物Circ19:5604583|5604936、以及检测该标志物的试剂用于制备胶质瘤诊断制剂的应用、还有试剂盒。

背景技术

胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见的肿瘤，约占全部颅内肿瘤的40％--50％。由于大多数胶质瘤呈浸润性生长且与周围脑组织边界不清，即使是最现代的神经外科技术也难以做到病理学上的全切除，因而胶质瘤术后复发率非常高，且随着手术和复发次数的增加，其恶性程度有增加的趋势。运用现代显微外科技术、放疗和化疗等综合治疗措施后，胶质瘤患者预后仍不理想，高度恶性的多形性胶质母细胞瘤(GBM)患者，1年和2年生存率仅为58％和31％。由于颅内病变的位置特殊性，加上手术治疗时不可避免的医源性损伤，生存者多并发神经功能障碍以及生活质量低下。近30年中恶性胶质瘤患者的临床预后没有明显改善。这充分反映了我们对脑胶质瘤发生、发展的生物学机制缺乏认识，因此不能在早期进行有效干预。因此，阐述胶质瘤发生、发展的分子机制，寻找和发现治疗神经胶质瘤生成的关键信号通路及调控因子，仍是神经胶质瘤临床和基础研究领域最重要的课题之一。

环状RNA是一类广泛且多样地存在于哺乳动物细胞中、具有调控基因表达作用的内源性非编码RNA分子，具有共价闭合的环形结构，广泛存在于各种细胞中，也是继microRNA(miRNA)后RNA家族的最新研究热点。近年来，随着深度测序技术的广泛应用和生物物理和信息学技术的快速发展，人们发现人类许多外显子的转录本可被非线性地反向剪接或通过基因重排而形成环状RNA，且它们在所有剪接转录本中占了相当大的比例。近年来也逐渐发现外泌体中也含有大量的环状RNA，可能发挥重要作用。外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。近年研究显示，外泌体是细胞与细胞间通讯的重要的分子，参与诸多生理与病理过程。外泌体中不仅包含蛋白质成分，还包括一些RNA成分，如微小RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA和mRNA、环状RNA(circular RNA，circRNA)。外泌体所携带的这些RNA统称为外泌体来源RNA，具有完整的序列结构和生物活性，有望作为液体活检分子标志物，在精准医学发展上有着光明的前景。

发明内容

本发明的第一个目的是：提供一种用于胶质瘤诊断的血清外泌体CircRNA标志物。

主要内容包括：一种用于胶质瘤诊断的血清外泌体CircRNA标志物Circ19:5604583|5604936，其序列如SEQ NO:1所示。

本发明的第二个目的是，提供检测所述的CircRNA标志物在血清外泌体中表达量的试剂在制备胶质瘤诊断制剂中的应用。

本发明的第三个目的是，提供一种胶质瘤诊断试剂盒，其能够测定血清外泌体中的Circ19:5604583|5604936的含量。

所述的胶质瘤诊断试剂盒，含有检测Circ19:5604583|5604936含量的PCR引物。优选引物的序列如SEQ NO:2和3所示。

所述的胶质瘤诊断试剂盒，除Circ19:5604583|5604936的引物外，还含有从血清中提取外泌体、由外泌体中提取RNA并进行逆转录及荧光定量PCR的所有试剂。

包括：

(1)提取血清外泌体所需试剂：Total Exosome Isolation Reagent(from serum)，可由Invitrogen公司购得，货号4478360；

(2)提取外泌体RNA所需试剂：Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇、无酶水；

(3)逆转录所需试剂：随机引物(Random Primer)、无酶水、5×逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶；

(4)荧光定量PCR所需试剂：Circ19:5604583|5604936上下游引物、GAPDH内参上下游引物、SYBR染料、无酶水。