[发明专利]一种大腹园蛛包裹丝蛋白全长基因及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于蜘蛛丝蛋白基因领域，特别涉及一种大腹园蛛包裹丝蛋白全长基因及其制备方法。

背景技术

蜘蛛丝是蜘蛛产生的一种天然的蛋白丝纤维，是其赖以生存的命绳，数十亿年的进化赋予了蜘蛛丝优异的机械强度和生物相容性，是一种优质、理想的天然生物材料，综合性能远超蚕丝以及目前最好的人造纤维材。其在高性能纤维、复合材料和生物医学工程材料等领域有着巨大的应用价值。目前为止国内外蛛丝蛋白纤维的人工仿生进展缓慢，由于蛛丝蛋白种类多、分子量大、且重复度高等特点，蛛丝蛋白全长编码基因的鉴定和克隆一直很难实现。1990年美国科学院院刊(PNAS)才刊登了第一条蜘蛛丝拖丝蛋白MaSp 1部分编码基因序列，由于蛛丝蛋白编码基因的特殊性，其克隆领域的进展一直极其缓慢，

不同的蛛丝纤维虽然机械性能差异较大，但从分子水平分析这些丝纤维的化学本质均为蛋白质。蛛丝蛋白结构较为典型，分为N端非重复区(NT，约130个氨基酸)、C端非重复区(CT，约110个氨基酸)以及中间重复区组成(Rp，占到整个蛋白序列的90％以上)，不同的蛛丝蛋白纤维性能则主要由重复区决定，NT和CT则主要参与蛛丝蛋白高浓度存储和成丝过程中的调节作用。

不同的蜘蛛丝虽然性能及分子水平的结构组成差异较大，但是它们拥有许多共同的优良品质：外观光滑、闪亮、耐紫外线性能强、密度非常低以及记忆性能好等，另外，蜘蛛丝还拥有良好的耐高温和低温特性，另外由于蜘蛛丝为蛋白质聚合纤维，可生物降解等，因此生物亲和性好，不会对环境造成污染，符合可持续发展的战略要求。蜘蛛丝的种种优良品质使其成为一种亟待开发的战略资源。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种大腹园蛛包裹丝蛋白全长基因及其制备方法，该基因包含有完整的NT端，重复区以及完整的CT端，用于编码大腹园蛛包裹丝蛋白；该丝纤维在力学性能以及生物相容性上都优于蚕丝以及人造纤维，而且对环境无污染，为在基因工程上大规模生产蛛蛋白奠定了基因基础。

本发明的一种大腹园蛛包裹丝蛋白全长基因，所述基因全长大小为10,338bp，共编码3445个氨基酸，具体序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白分子量为330.0kDa。

所述全长基因中NT端大小为489bp，编码163个氨基酸，具体序列如SEQ ID NO.2所示。

重复区大小为9117bp，共编码3039个氨基酸，具体序列如SEQ ID NO.3所示。

CT端大小为297bp，共编码99个氨基酸，具体序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的一种大腹园蛛包裹丝蛋白全长基因的制备方法，包括如下步骤：

(1)根据现有的蜘蛛包裹丝的AcSp蛋白基因，在NT端简并引物，在重复区设计2条特异性引物，通过简并PCR扩增得到部分的NT端基因序列；

(2)根据步骤(1)所获得的序列分别设计2对特异性引物及1条锚定引物，通过锚定PCR将NT端补齐；

(3)根据步骤(2)所获得的包含完整NT端序列，在NT端5’末端设计1条正向引物，在CT端3’末端设计1条反向引物，用于扩增全长AcSp基因；

(4)对步骤(3)所得PCR产物进行琼脂糖凝胶切胶回收后，与载体pEASY-Blunt Zero Cloning Vector进行平末端连接反应，之后进行连接产物回收；

(5)对步骤(4)的连接产物进行平末端克隆，使用热击的转化方法，转入DH5α感受态细胞中进行转化，将转化后的菌液涂布在具有Amp和Kan的双抗性的LB固体培养基上，过夜培养后，挑取单克隆进行PCR检测；

(6)将步骤(5)中得到的阳性单克隆的质粒进行完整测序，最终得到大腹园蛛包裹丝蛋白全长基因。

所述步骤(1)中用于扩增部分NT端的正向引物：TGTTTYCARGCNGTNATG；

反向引物：GCACCACTGGTCTGAGAGAAC。

用简并PCR获得的部分NT端序列的正向引物为简并引物，反向引物为重复区的特异性引物。

所述步骤(1)中的简并PCR的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次。

所述步骤(2)中的用于补全NT端的特异性引物1：GACTTGTTGCTTGAAACGATGCTG；用于补全NT端的特异性引物2：GCAGAGAAAGCTCCTTGGTCTTG；

锚定引物：ACTCCTGTGGAACCATCGGACGGGGGG。