[发明专利]电渗析法分离提取全细胞催化液中的戊二胺的方法

权利要求书

1.从全细胞催化液中分离提取1,5-戊二胺的方法，其特征在于，

将全细胞催化液中的上清液加入双极膜电渗析设备的盐槽中电渗析，得碱槽溶液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括，将所述的碱槽溶液减压蒸馏，真空度为-0.095Mpa，温度为80℃--120℃，得到高纯度戊二胺。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括，所述的碱槽溶液和有机溶剂加入萃取瓶中萃取，收集有机相，加入精馏装置进行减压连续精馏，收集馏分，真空度为-0.095Mpa，温度为80℃--120℃，得到高纯度戊二胺。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的上清液，其制备方法为将配制含有300g/L赖氨酸盐酸盐和0.1mmol/L PLP的催化液体系，调控温度至37℃以后，发酵罐搅拌转速设置为500rpm，加入10g/L湿菌体开始全细胞催化，催化过程中补加硫酸调节pH维持在7.0左右，催化2h，得到上清液。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的湿菌体，其制备方法为将刮取工程菌E.coli BL21(DE3)P_cadB::P_T7/pET28a-cadA^*菌苔接入培养基中，在37℃220rpm摇床中培养4h，得到种子液，OD₆₀₀为4-5；培养所得的种子液按2％的接种量接入含有无机盐培养基的发酵罐中，培养温度为37℃，DO控制在30％以上，罐压控制在0.02-0.10MPa；通过流加补料液使培养液中葡萄糖的浓度维持在5g/L以下，当培养液中菌体OD₆₀₀达到30-40时加入0.1mM诱导剂IPTG，2h后菌体培养液OD₆₀₀达到80左右，离心获得湿菌体。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的工程菌E.coli BL21(DE3)P_cadB::P_T7/pET28a-cadA^*，其制备方法为将质粒pET28a-cadA^*转化至E.coli BL21P_cadB::PT7的感受态细胞，在卡那霉素的LB平板上筛选，获得工程菌E.coli BL21P_cadB::P_T7/pET28a-cadA^*。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的质粒pET28a-cadA^*，其获得方法为：

在pET28a(+)表达载体的T7启动子和RBS之后插入优化的赖氨酸脱羧酶基因cadA^*的ORF；

以优化设计的序列设计引物，以野生型大肠杆菌K12W3110菌株的基因组DNA为模板，使用高保真聚合酶KAPA HiFi^TM HotStar，以P1和P2为引物，PCR扩增cadA^*基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，获得改造的赖氨酸脱羧酶基因cadA；

使用限制性内切酶Nco I和Sal I双酶切赖氨酸脱羧酶基因cadA*的DNA片段和pET28a(+)质粒，得到酶切后的赖氨酸脱羧酶基因cadA*基因片段和载体大片段；

将酶切后的赖氨酸脱羧酶基因cadA*基因片段与载体大片段连接，转化至大肠杆菌的感受态细胞，在卡那霉素的LB平板上筛选，获得质粒pET28a-cadA^*。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括，所述的有机溶剂包括壬醇、醇类溶剂、烷烃类溶剂或酯类溶剂。