[发明专利]基于Taqman‑MGB探针的人JAK2V617F突变检测试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种基于Taqman-MGB探针的人JAK2 V617F突变检测试剂盒和方法。

背景技术

骨髓增殖性肿瘤(myelo-proliferative neoplasm/myelodysplastic/myeloprolifer-ative disorder，MPN/MDS/MPD)是一种惰性肿瘤，主要包括慢性粒细胞白血病(CML)，真性红细胞增多症(PV)，原发性血小板增多症(ET)，和原发性骨髓纤维化(PMF)，慢性中性粒细胞白血病(CNL)，慢性嗜酸细胞白血病/高嗜酸细胞综合症(CEL/HES)等。目前临床上所指的MPD通常为反映多能造血干细胞转化的PV、IMF和ET。MPD发病无特点且潜伏期长，常见于40-70岁，诊断时年轻病例约占20％。由于骨髓增殖性疾病患者缺乏典型的临床症状，除了CML以外，长期以来MPD中其他亚型的诊断主要依赖于形态学的检查，这往往不能确诊MPD的类型，进而患者无法得到有效的治疗。

JAK2是JAK(非受体型酪氨酸蛋白激酶之一，Janus激酶)家族中受到高度关注的一员，其广泛分布于体细胞胞质中，参与造血和免疫等系统的信号转导。多项研究证实，PV、ET、PMF等疾病中存在JAK2激酶V617F点突变。该突变位点在DNA序列的第1849位碱基，由胸腺嘧啶替代了原有的鸟嘌呤(G-T)，导致编码蛋白第617位的苯丙氨酸被缬氨酸代替，引起该基因编码的酪氨酸激酶活性增高。JAK2 V617F是发生于干细胞水平的突变，2008年世界卫生组织将JAK2 V617F突变纳入了PV、PT和PMF的诊断标准。因此JAK2 V617F的检测已经成为PV、ET等骨髓增殖性肿瘤(MPN)的主要分子致病机制和诊断标志。

目前，对PV和ET的治疗方法主要是迅速放血(去除过多血小板或是降低血容量)和药物治疗(放射性核素磷、羟基脲或马利兰等)。PMF的治疗方法主要是对症和支持治疗，如巨脾切除或罗钙全(1，25(OH)₂D₃)治疗纤维化等。JAK2 V617F突变结合骨髓活检的组织学结果，可为ET和PMF诊断及MPD治疗提供依据。此外，JAK2突变对MPD患者的预后也有一定影响。在ET和PV患者中，JAK2 V617F表达高的，预后差，而在PMF患者中，JAK2 V617F表达低的，预后差。

JAK2 V617F突变检测多采用多采用PCR-限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、突变特异性扩增系统(amplification refractory mutation system，ARMS)或者直接测序分析等方法，但前两者存在假阳性(或灵敏度较低)，无法定量检测，后者检测较准确，但费时耗资，在MPD随访和分子缓解判断中的作用有限不适于临床诊断的推广应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有良好特异性以及灵敏度的基于Taqman-MGB探针的人JAK2 V617F突变检测试剂盒，该试剂盒具有检测分辨率高的优势。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

基于Taqman-MGB探针的人JAK2 V617F突变检测试剂盒，包括有针对人JAK2 V617F的如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示的引物和如SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.14所示的探针；所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。

SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.14在检测体系中的浓度为200nM/ml；比例为SEQ ID NO.14：SEQ ID NO.13的用量比1:2。从而使检测纯合型样本时两通道检测的Ct差值足够大，检测杂合型样本时的Ct差值足够小。

在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括有缓冲液、镁离子、dNTP、Taq酶。

在其中一个实施例中，所述探针5’端的荧光基团为FAM、VIC、或HEX中的一种，3’端的淬灭基团为NFQ。

本发明的另一个目的是提供一种基于Taqman-MGB探针的人JAK2 V617F突变检测方法。

实现上述目的技术方案如下。

基于Taqman-MGB探针的人JAK2 V617F突变检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测模板的DNA；

(2)配制反应液，在缓冲液中加入镁离子、dNTP、上述引物和探针、Taq酶；