[发明专利]用于检测高血压患者叶酸代谢相关基因多态性的引物对及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及体外核酸检测技术领域，尤其涉及一种用于检测高血压患者叶酸代谢相关基因多态性的引物对及试剂盒。

背景技术

叶酸是由喋呤啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸等组成的化合物，是一种水溶性B族维生素。它存在于许多植物和动物组织中，人体不能合成，必须从外界摄取。

叶酸是DNA及RNA合成中起重要作用酶的辅助因子，为核苷酸从头合成提供一碳单位，在氨基酸的甲基化循环中参与甲基转运，它在机体内的活性单位是5-甲基四氢叶酸。另一方面，叶酸作为同型半胱氨酸(Hcy)代谢中最重要的辅酶，其缺乏会导致Hcy下游代谢障碍，进一步导致其在血液中堆积，表现出血清中Hcy浓度高，引起机体出现多系统损伤。

5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)位于第一号染色体1ρ36.3位置，是參与体内叶酸代谢的关键酶，与体内叶酸/同型半胱氨酸(HCY)的代谢和蛋氨酸的合成有关，催化5，10-亚甲基四氢叶酸转换成5-甲基四氢叶酸盐，使之能为同型半胱氨酸提供甲基形成甲硫氨酸，并且使血液中的同型半胱氨酸量保持在一个较低的水平。该基因最常见的两个单核苷酸多态性667C>T和1298A>C在中国人群中发生的概率分别为45.2％和18.6％。研究发现，MTHFR 677C>T突变可造成其编码的氨基酸由丙氨酸变成缬氨酸，引起耐热性和酶活性的下降，杂合MTHFR 677CT酶活性下降30％，纯合667TT下降65％以上，在低叶酸环境下，纯合667TT可显著升高血浆同型半胱氨酸的浓度；MTHFR 1298A>C突变引起编码的氨基酸由谷氨酸转变为丙氨酸，也会导致酶活性下降，但是下降的程度比667T突变轻微，且位点A1298C与位点C667T突变有协同效应。两种情况均阻碍了叶酸代谢，引起一系列疾病发病风险增加，而合理补充叶酸可以很大程度的防止基因缺陷引发的不良后果。

甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)也是參与体内叶酸代谢和同型半胱氨酸代谢的关键酶，其编码基因位于5ρ15.3-ρ15.2。A66G位点是MTRR上的主要突变，MTHFR 66A>G突变可造成其编码的氨基酸由异亮氨酸变成甲硫氨酸，突变导致其酶活性与同型半胱氨酸再甲基化速率降低，引起高同型半胱氨酸血症。该位点在中国人群中该多态的频率分布为：A占76％，G占24％左右。

MTHFR(C667T)、MTHFR(A1298C)和MTRR(A66G)位点的基因发生突变，均会导致代谢途径中酶活性降低，从而影响人体内叶酸代谢的效率，使血液中同型半胱氨酸的浓度升高。《中国高血压防治指南》中已明确指出，高同型半胱氨酸是我国高血压患者最常见的危险因素，并与脑卒中呈显著正相关，可使脑卒中的风险增加。

焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序(确定DNA中核苷酸的顺序)方法，是新一代DNA序列分析技术。它是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。通过分析岀峰情况，达到测定DNA序列的目的。

医院用于基因分型检测的“金标准”是PCR-直接测序法，但直接测序法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20％以上的肿瘤组织，对于含<10％突变细胞的肿瘤组织以及外周血，常规PCR-直接测序法几乎无能为力。相比于直接测序法，焦磷酸测序的灵敏性更高、成本更低。