[发明专利]微环DNA表达连接人和猴CD20与效应细胞抗原的桥接分子及其应用

权利要求书

1.一种表达人-猴交叉反应性靶细胞-效应细胞桥接分子(Bridge between human-monkey cross-reactive target cells and effector cells，hmBTEC)的重组基因载体，其特征在于，所述桥接分子包含：与靶细胞作用靶点特异性结合的部分A，和与效应细胞作用靶点特异性结合的部分B；优选的，所述重组基因载体选自非病毒基因载体，如标准质粒或其它环状表达盒子；更优选的，所述重组基因载体选自微环DNA载体；再优选的，所述桥接分子选自蛋白或多肽；更优选的，所述桥接分子选自双特异性抗体；特别优选的，所述部分A和所述部分B分别选自蛋白分子或多肽分子；最优选的，所述部分A和部分B分别选自Fab、Fab’、单链抗体(scFv)、单域抗体(V_HH)、单链T细胞受体(scTCR)和其它。

2.如权利要求1所述的重组基因载体，其特征在于，所述靶细胞选自B细胞或B系癌细胞；所述效应细胞选自T细胞、NK细胞或其它；优选的，所述部分A特异性结合的作用靶点选自：CD20；再优选的，所述部分B特异性结合的作用靶点选自：CD3、CD16、CD28、4-1BB、OX40、TCR、CD56、NKG2D、NCR或其它。

3.如权利要求1或2所述的重组基因载体，其特征在于，

(1)所述部分A特异性结合CD20分子，所述部分B特异性结合CD3分子；优选的，所述部分A包含：重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，和轻链可变区，其氨基酸序列如SEQID NO：3所示；以及，所述部分B包含：重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，和轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；或，

(2)所述部分A特异性结合CD20分子，所述部分B特异性结合CD16分子；优选的，所述部分A包含：重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，和轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；以及，所述部分B包含：重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，和轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。

4.如权利要求1-3中任一项所述的重组基因载体，其特征在于，所述重组基因载体包含：部分A的编码基因，和/或包含部分B的编码基因；优选的，部分A的编码基因包含：重链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，和/或轻链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；优选的，部分B的编码基因包含：重链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6或10所示，和/或轻链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：8或12所示。

5.如权利要求1-4中任一项所述的重组基因载体，其特征在于，所述重组基因载体包含所述桥接分子的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13-18中任一项所示。

6.如权利要求1-5中任一项所述的重组基因载体所表达的桥接分子。

7.如权利要求1-5中任一项所述的重组基因载体的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：

(1)从现有技术中分别获取人-猴交叉反应性抗CD20抗体、抗CD3抗体及抗CD16抗体的重链可变区(VH)序列、轻链可变区(VL)序列；

(2)根据上述VH、VL序列设计成多种组合形式的桥接分子，并构建表达所述桥接分子的重组基因载体；

任选的，(3)在体内外鉴定所述桥接分子的表达水平，并检测表达产物介导T细胞或NK细胞对CD20阳性细胞的杀伤效果；

优选的，所述桥接分子选自双特异性抗体；优选的，所述重组基因载体选自表达双特异性抗体的微环DNA载体(MC.BsAb)；优选的，所述猴选自食蟹猴。

8.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求1-5中任一项所述的重组基因载体，或由权利要求7所述的制备方法所得到的重组基因载体；优选的，所述宿主细胞包括细菌细胞、酵母菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。