[发明专利]单分子条件下检测前列腺特异抗原的方法

说明书

本发明涉及一种单分子条件下检测前列腺特异抗原的方法，提出利用DNA四面体构建三维的检测基底，在其上连接的核酸适配体（aptamer），识别并捕获PSA；引入连接aptamer的量子点，实现检测信号的测定，包括DNA四面体与aptamer组装、量子点与aptamer组装、载带aptamer的DNA四面体在玻片上的固定和检测。本发明利用DNA四面体作为三维修饰基底，减少界面的非特异性吸附，提高界面均一性及检测信噪比。利用DNA四面体支撑aptamer，减少界面对aptamer的吸附，提高对靶标的捕获能力。利用单分子的检测技术，对单个靶标进行可视化检测，进一步提高检测灵敏度和信噪比。

技术领域

本发明涉及一种单分子条件下检测前列腺特异抗原的方法，具体涉及利用DNA四面体构建检测基底，利用特异性核酸适配体检测前列腺特异抗原的方法。本发明属于生物传感检测领域。

背景技术

作为男性恶性肿瘤之一的前列腺癌，在中国已成爆发式增长。据统计，近二十年来，前列腺癌的发病率增长超过10倍，而伴随中国社会老龄化的不断加剧，前列腺癌的发病率还将不断上升。然而，对前列腺癌而言，其发病率与致死率存在较大差异。通过对前列腺癌靶标的筛查，早期的前列腺癌基本可以治愈。现有的早期诊断主要通过检测前列腺特异抗原（PSA）进行，然而目前其检测灵敏度和特异性存在问题，因此在医药应用方面具有很大争议。

区别于传统的光学成像，单分子检测技术的出现将成像方式推至新的阶段：揭示隐藏在整体平均水平下分子的不均一性和其独特的动态过程。利用单分子荧光显微术，能够发现分子间的差异及分子与其所处微纳环境的相互作用，并且通过对单个分子的实时追踪，可以得到单个分子实时的动态变化。基于此方法，多种酶分子与无机纳米催化剂的催化特性被解析（Science 1998，Nature Materials 2008等）。同时单分子荧光检测方法具有极佳的信噪比、检测灵敏度及极高的时间分辨率，因而也被应用至核酸检测方面（NatureCommunication 2015）。

针对PSA检测中存在的灵敏度和特异性问题，本发明利用单分子检测技术，构建一种灵敏的检测PSA的方法。本发明提出利用DNA四面体构建三维的检测基底，在其上连接的核酸适配体（aptamer），识别并捕获PSA；引入连接aptamer的量子点，实现检测信号的测定。

发明内容

本发明目的在于针对现有技术的不足，本发明目的在于：提出一种单分子条件下检测前列腺特异抗原的方法，利用DNA四面体构建一种在单分子条件下检测PSA的方法。

在本发明的技术方案中，利用DNA四面体构建三维的检测基底，在其上连接的核酸适配体aptamer，识别并捕获PSA；引入连接aptamer的量子点，实现检测信号的测定，包括下述步骤：

（1）DNA四面体与aptamer组装：将DNA 1-5以一定比例混合均匀，于高盐浓度缓冲液中高温退火形成载带有aptamer的DNA四面体；

（2）量子点与aptamer组装：将一定浓度的量子点与生物素修饰的aptamer DNA 6在1×PBS缓冲溶液中以一定比例混合均匀，于室温孵育；随后混合液离心洗去过量DNA，沉淀物采用PBS缓冲溶液重旋，4℃保存；

（3）载带aptamer的DNA四面体在玻片上的固定：将DNA四面体与aptamer组装体稀释至一定浓度后，与链霉亲和素修饰的玻片孵育一定时间后，缓冲液冲洗干净过量组装体；

（4）检测：制备样品池，在样品池中滴加100 μL含有PSA的反应溶液，孵育一定时间后，洗去过量PSA；加入一定浓度的连接有aptamer的量子点，孵育一定时间后，洗去过量的量子点；首先激光激发四面体所带荧光，随后更换激光通路，激发量子点荧光，通过二者共定位确定信号采集位点。

本发明将DNA四面体连接特异性的核酸适配体aptamer，识别并捕获PSA；同时引入连接aptamer的量子点，实现检测信号的可视化。