[发明专利]引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，其病原为口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)。口蹄疫病毒属于微RNA病毒科口蹄疫病毒属，基因组为单股正链RNA，全长约有8500个核苷酸，病毒衣壳由4种蛋白即VP1、VP2、VP3和VP4各60个拷贝组成。该病传播途径多、传染性强、多种动物共患，严重危害家畜生产力和畜产品质量，给畜牧业和进出口贸易造成较大的经济损失。

口蹄疫病毒共有7种血清型：A、O、C、Asia I、SAT1、SAT2和SAT3，80多个亚型和众多差异明显的病毒株。1928年国际兽医局决定采用0、A、C三型为国际通用的命名。1948年命名了南非1型(SAT 1)、南非2型(SAT2)、南非3型(SAT 3)。1954年报道了亚洲I型(Asial I)的存在。根据血清型间的同源性将其分为两群，即O、A、C和AsialI型为一群，SAT1、SAT2、SAT3型为一群，两群之间血清同源性仅为25％-40％，群内同源性可达60％-70％，型间不能交叉免疫。同型内又分若干亚型，各亚型间仅有部分交叉免疫性。

口蹄疫主要危害牛、猪、羊等偶蹄动物，发病率极高，并能形成大范围流行，所以国际兽医局(OIE)和联合国粮农组织(FAO)将其排在A类传染病的首位。阿拉伯学者早在14、15世纪就己记载了类似口蹄疫的疾病。1514年，意大利学者比较详细记述了口蹄疫。口蹄疫在欧洲的流行晟为严重，危害极大。一般相隔10年左右就有一次大流行。在1967-1968年英国和前苏联的一次流行中，仅英国就捕杀牲畜42万头。该病1977年传入亚洲，波及马来西亚等13个国家和地区。1997年我国台湾的一次大暴发，殃及6000多个猪场。

控制FMD关键在于早发现、早隔离、早预防，因而建立一种快速、灵敏、特异、可靠的诊断方法非常重要。

目前，国内常规的病原学诊断方法主要有单重、多重RT-PCR、酶联免疫吸附试验、病毒的分离与鉴定、病毒抗原检测、琼脂扩散试验、补体结合试验、免疫扩散沉淀试验、病毒中和试验、间接血凝试验、乳胶凝集试验等，这些方法或需长时间才能获得检测结果，灵敏度低等。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种速度快、灵敏度高、稳定性好、特异性强，能够同时扩增O型、A型及AsiaI型口蹄疫病毒套式RT-PCR(RT-nPCR)方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了引物组，包括外套引物和内套引物；

所述外套引物的上游引物具有如SEQ ID No.1所示的序列；

所述外套引物的下游引物具有如SEQ ID No.2所示的序列；

所述内套引物的上游引物具有如SEQ ID No.3所示的序列；

所述内套引物的下游引物具有如SEQ ID No.4所示的序列。

本发明还提供了所述的引物组在扩增O型、A型和/或AsiaI型口蹄疫病毒中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述扩增为套式RT-PCR。

本发明还提供了一种试剂盒，包括本发明所述的引物组。

本发明还提供了所述的试剂盒在扩增O型、A型和/或AsiaI型口蹄疫病毒中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述扩增为套式RT-PCR。

本发明还提供了一种扩增口蹄疫病毒的方法，包括如下步骤：

步骤1：提取获得总RNA；

步骤2：以步骤1获得的总RNA为模板，通过如权利要求1所述的引物组中的外套引物经第一次扩增，获得第一次扩增产物；

步骤3：以步骤2获得的所述第一次扩增产物为模板，通过如权利要求1所述的引物组中内套引物经第二次扩增，获得扩增产物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述第一次扩增的反应体系为：

所述第一次扩增的反应条件为：

在本发明的一些具体实施方案中，所述第二次扩增的反应体系为：

所述第二次扩增的反应条件为：

在本发明的一些具体实施方案中，所述口蹄疫病毒的血清型为O型、A型和/或AsiaI型。

此外，本发明还提供了口蹄疫病毒的检测方法，包括如下步骤：