[发明专利]一种快速获取大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体序列的测序方法及引物序列

权利要求书

1.一种快速获取大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体序列的测序方法，其特征在于，包括：

步骤1、为目的基因的cDNA添加接头序列；

步骤2、用接头序列和大鼠抗体可变区特异性引物通过PCR扩增大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区；

步骤3、用PCR产物直接测定单克隆抗体序列。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中的具体方法为：

1.1根据大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体基因设计特异性逆转录引物，设计接头序列，接头序列3’末端有至少3个连续的鸟嘌呤；

1.2在逆转录体系中加入接头序列和特异性逆转录引物，以接头序列作为模板转换引物，在逆转录即将完成时，接头序列3’端的oligo(dG)会与cDNA末端的dC配对，具有末端转移酶活性的逆转录酶则发生模板转换，以接头序列为模板继续进行链延伸，从而得到3’端添加了接头序列的单链cDNA片段。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1.1中，所述接头序列为5’-RACE接头序列，该5’-RACE接头序列为5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACACrGrGrGp-3’。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中，以3’端添加了接头序列的单链cDNA片段为模板，用目的基因的特异性引物进行巢式PCR扩增；对获得的巢式PCR扩增片段进行电泳，切胶回收纯化PCR产物。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，轻链根据恒定区抗原性的不同,分为kappa链和lambda链，

大鼠kappa轻链扩增引物为5’-AGGATGATGTCTTATGAACAA-3’(Rat-CK)；

大鼠lambda轻链扩增引物为5’-ACCATTTGCCTTCCAGGCCAC-3’(Rat-CL1)，5’-ACCATCTGCCTTCCAGACCAC-3’(Rat-CL2)两条引物1:1的混合物；

大鼠重链扩增引物为5’-GCTGGACAGGGCTCCAGAGTTCC-3’(Rat-CHR)。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3中，对纯化后的PCR产物进行测序，获得目的基因3’末端至5’末端的序列，验证后即得到5’端未知目的基因的完整编码序列。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中，测序时，

大鼠重链测序引物为5’-GCTGGACAGGGCTCCAGAGTTCC-3’(Rat-CHR)；

大鼠kappa轻链测序引物为5’-AGGATGATGTCTTATGAACAA-3’(Rat-CK)；

大鼠lambda轻链测序引物为5’-ACCATTTGCCTTCCAGGCCAC-3’(Rat-CL1)，5’-ACCATCTGCCTTCCAGACCAC-3’(Rat-CL2)两条引物1:1的混合物。

8.用于快速获取大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体序列的测序方法的PCR扩增引物，其特征在于，大鼠重链扩增引物为5’-GCTGGACAGGGCTCCAGAGTTCC-3’(Rat-CHR)；

大鼠kappa轻链扩增引物为5’-AGGATGATGTCTTATGAACAA-3’(Rat-CK)；

大鼠lambda轻链测序引物为5’-ACCATTTGCCTTCCAGGCCAC-3’(Rat-CL1)，5’-ACCATCTGCCTTCCAGACCAC-3’(Rat-CL2)两条引物1：1的混合物。

9.用于快速获取大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体序列的测序方法的接头引物，其特征在于，所述接头序列3’末端有至少3个连续的鸟嘌呤，所述接头序列为5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACACrGrGrGp-3’。