[发明专利]生产左旋多巴大肠杆菌重组菌株及其构建方法与应用

说明书

本发明提供一种生产左旋多巴的大肠杆菌(Escherichia coli)重组菌株T002，其通过上调3‑脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达而增强3‑脱氢莽草酸脱氢酶酶活，进而可生产左旋多巴。该菌株可以利用葡萄糖无机盐培养基发酵生产左旋多巴，降低了培养基成本，从而降低了左旋多巴的生产成本。且上述重组菌株不含质粒，遗传性稳定。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及生产左旋多巴重组大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

左旋多巴(L-DOPA)又名3-羟基-L-酪氨酸，是一种在医药卫生、保健美容等诸方面有显著功效的氨基酸衍生物。自1908年以来，世界各国将其广泛应用于临床。目前左旋多巴是治疗震颤麻痹最有效的药物。它通过血脑屏障进入脑组织，发挥作用。适用于原发性震颤麻痹症及非药原性震颤麻痹综合征。同时它对强直、运动障碍、流涎、动脉危象等均有疗效。左旋多巴是由酪氨酸形成儿茶酚胺的中间产物，即多巴胺的前体。被吸收入血的L-多巴约95％被外围组织中多巴脱羧酶脱羧，形成儿茶酚胺，不易通过血脑屏障，反而引起许多不良反应。仅有1％的L-多巴进入脑循环，到达中枢神经系统，转变为儿茶酚胺发挥治疗作用。

L-DOPA及复方左旋多巴(如美多芭)治疗常见老年病帕金森氏病己有40多年的历史，至今仍是治疗帕金森病最有效的药物，且耐受性好，不但能改善运动迟缓，缓解主要症状，而且能延长帕金森病患者的寿命。据统计，普通人群帕金森病的发病率为 0.1％，60岁以上老人的发病率为1％，80岁以上的发病率为2％。随着人口老龄化速度的加快，对L-DOPA的需求将迅速增加。左旋多巴2007年在世界畅销药中排名100。

目前，左旋多巴的制备方法主要有化学合成、植物提取、生物酶催化以及生物发酵。工业化化学合成生产左旋多巴多以香草醛和乙内酰脲为原料，经过8步的反应制得。尽管目前商品化左旋多巴主要通过不对称法合成，但化学合成过程中需要大量的金属催化物，并且过程繁杂，产物的转化效率和旋光活性均较低，而且存在着成本高、环境污染严重等众多问题。所以开发新的合成方法和思路是今后研究的重点和方向。

天然植物中存在左旋多巴。1913年生物化学家Guggenheim从蚕豆中提取得到左旋多巴。之后在很多植物中均发现存在左旋多巴，如猫豆、藜豆等，其中猫豆中的左旋多巴含量最高达到6％～9％，是提取左旋多巴最主要的原料。通过改良提取技术高从猫豆中提取左旋多巴的得率明显提高，从1.5％提高到3.4％，纯度达到99.9％。虽然从植物中直接提取左旋多巴是目前的一种方法，但是由于受到原料来源的限制，并且提取步骤繁杂，产量小，远不能满足市场需求。

生物酶转化法主要以L-酪氨酸或酚类物质为底物，通过来源于微生物的酶体外制取左旋多巴。目前已报道2种酶可以催化多巴的生成。一种是酪氨酸酚解酶(Tyrosinephenol lyase，TPL)(EC4.1.99.2)，其可催化邻苯二酚、丙酮酸和氨水生成左旋多巴，催化反应过程中需要磷酸吡哆醛(胺)为辅酶、钾离子和氨离子为辅因子。该生物催化体系中，当邻苯二酚及丙酮酸的浓度较高时会对TPL产生抑制作用甚至不可逆失活。虽然在发酵体系中加入一些硼酸根离子可以减轻邻苯二酚对酶的抑制作用，但该催化体系仍然存在着一些缺点，例如：反应时间长、转化效率不高、分离成本高、原料比较昂贵等。另一种是酪氨酸酶(Tyrosinase)，其可以酪氨酸直接作为底物，催化合成左旋多巴。申请公告号为CN104726513的中国发明专利公开了一种酶法制备左旋多巴的方法，其在缓冲溶液中加入酪氨酸和菌体细胞，在18～30℃，pH5.0～6.0 条件下进行酶促反应，将酪氨酸转化为左旋多巴。左旋多巴浓度可达27g/L，酪氨酸摩尔转化率可达99％以上，且条件温和，对映体选择性高，无消旋作用发生。但是生物酶法由于需要昂贵的原材料，使得生产成本高，难以适应工业化生产应用。