[发明专利]一种地衣芽孢杆菌与酪酸菌复合菌剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及补料分批发酵制备地衣芽孢杆菌与酪酸菌复合菌剂的方法。

背景技术

由于目前饲料中添加抗生素的现象十分普遍，出于安全原因，许多国家禁止利用一些畜产品下脚料生产的肉骨粉等动物蛋白原料用于饲料，因此，从安全与成本角度考虑，将植物源蛋白作为动物蛋白原料的替代品已经成为一种趋势。但是，要高效利用植物源蛋白，需要解决影响消化吸收的抗营养因子、适口性等问题；同时在幼禽畜养殖防治下痢中，抗生素的使用严重威胁了我们的食品安全，因此，在饲料生产中，需要采用在功能上能够替代不良副作用添加剂的微生态添加剂产品。然而传统固态发酵复合菌固态发酵过程中，多菌种同时接种无法同时满足不同菌发酵要求，造成发酵不彻底。多菌种组合固态整体发酵的关键控制点在于把握和控制好好氧与厌氧二个阶段，掌握好好氧向厌氧的转换。

公布号 CN 103478417 A提供了一种二次接种分段固态发酵生产发酵豆粕的方法，将枯草芽孢杆菌液、假丝酵母菌液和乳酸杆菌液混合得到的混合菌液接入到去皮豆粕，混合发酵；将乳酸杆菌液接入到发酵物中，混合，厌氧发酵，得到发酵豆粕。该方法能够满足好氧菌与厌氧菌的不同需求，可生产制备高品质的发酵豆粕。虽然该专利也考虑到了不同菌种发酵的条件，但是菌种的种类是影响复配和发酵条件的关键因素，对于地衣芽孢杆菌和酪酸菌的复配没有相关的技术启示。

地衣芽孢杆菌细胞形态和排列呈杆状、单生，属革兰氏阳性好氧菌，生长过程中可迅速消耗环境中的游离氧气，在肠道创造一个厌氧环境，促进肠道益生菌(乳酸菌、双歧杆菌及丁酸梭菌等)的生长，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌。地衣芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性，能够降解饲料中的抗营养因子，地衣芽孢杆菌形成芽孢后具有抗逆性强、耐热、存储时间长等优点。

酪酸菌，又名丁酸梭菌，是梭状芽孢杆菌属的其中一种，存在于奶酪、天然酸奶、土壤及人和动物粪便中，是人和动物肠道的正常菌群。丁酸梭菌是一种厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，菌体呈直或者弯形，单个或成对、短链，有鞭毛可运动，菌体可形成芽孢，芽孢偏心或次端生(内生)，呈圆形或椭圆形，无胞外壁和附属丝。丁酸梭菌通过消化道时，能够耐胃酸及胆盐的恶劣环境，是调节动物肠道微生态平衡的有益菌。

由于酪酸菌是一种严格厌氧菌，单独生产的话，需要通过石蜡油、氮气或二氧化碳等维持的厌氧环境来生产，设备要求较高，生产成本大；而地衣芽孢杆菌属于好氧菌，采用联合培养的方式，常常导致出现两种菌都生长不稳定或严重退化的现象。

发明内容

本发明的目的在于克服单菌培养过程中生产周期长、设备要求高等缺点，提供一种将两段式系统发酵工艺，将好氧菌与厌氧菌协同发酵，地衣芽孢杆菌能够为酪酸菌提供厌氧环境和丰富的营养物质，加快了后期酪酸菌的生长速度，同时采用补料分批发酵，提高了菌体密度，简化生产工艺，大大提高生产效率。

本发明所采用的技术方案为：一种地衣芽孢杆菌与酪酸菌复合菌剂的制备方法，包括菌种的活化及扩配、种子罐培养、发酵罐培养、菌体离心收集、载体吸附及低温干燥，具体为：

1、菌种活化及扩大培养。

（1）地衣芽孢杆菌：

a）菌种活化：取地衣芽孢杆菌甘油管菌种，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，120~160 r/min，30~37℃培养24h，牛肉膏蛋白胨平板计数。

b）菌种扩配：挑选牛肉膏蛋白胨平板计数上的单菌落，接种牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30~37℃，120~160 r/min振荡培养24h。

（2）酪酸菌：

a）菌种活化：取酪酸菌甘油管菌种，接种到相应的种子培养基中，32~37℃厌氧培养12~18h，RCM平板计数。

b）菌种扩配：挑选RCM平板上的单菌落，接种于RCM液体培养基中，置于厌氧袋中，37℃厌氧培养24h。

2、种子罐培养菌种。

（1）一级种子罐培养

a）地衣芽孢杆菌：将经过扩大培养的地衣芽孢杆菌接种到地衣芽孢杆菌一级种子罐中，接种量1~3%，使用无菌空气通入罐中，罐压调整为0.03~0.05MPa，通风比控制为1:0.6~1:1，转速120~180r/min，温度32~37℃，培养时间16~20h。

b）酪酸菌：将经过扩大培养的酪酸菌接种到酪酸菌一级种子罐中，接种量1~3%，使用氮气从罐顶通入罐中，罐压调整为0.02~0.04MPa，转速控制60~120 r/min，温度控制在32~37℃，厌氧培养16~24h。

（2）二级种子罐培养