[发明专利]生产3-脱氢莽草酸大肠杆菌重组菌株及其构建方法与应用

权利要求书

1.生产3-脱氢莽草酸的大肠杆菌（Escherichia coli）重组菌株WJ004，其以大肠杆菌DSM1576为出发菌株,通过在aroE起始密码子上游插入合成调控元件P1而下调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶aroE的表达或不表达aroE,所述合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的重组菌株WJ004，在aroE起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1。

3.如权利要求2所述的重组菌株WJ004，所述aroE的原始起始密码子ATG替换为稀有密码子TTG或GTG。

4.权利要求1-3中任一项所述的重组菌株WJ004的构建方法，包括如下步骤：

以大肠杆菌DSM1576为出发菌株，通过同源重组方法，在3-脱氢莽草酸脱氢酶aroE起始密码子上游插入合成调控元件P1，合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示。

5.如权利要求4所述的构建方法，用稀有起始密码子TTG或GTG替换原始起始密码子ATG来调控aroE的表达。

6.权利要求1-3中任一项所述的重组菌株WJ004或由其传代而产生的重组菌在生产3-脱氢莽草酸中的应用。

7.发酵生产3-脱氢莽草酸的方法，包括利用权利要求1-3中任一项所述的重组菌株WJ004进行发酵。

8.生产3-脱氢莽草酸的大肠杆菌重组菌株WJ006，其以权利要求1-3中任一项所述的重组菌株WJ004为出发菌株，所述重组菌株WJ006的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroF中第443位的碱基C突变为T形成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶突变基因aroF*，所述突变基因aroF*的基因序列如SEQ ID NO:5所示。

9.如权利要求8所述的重组菌株WJ006，在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因的起始密码子上游插入合成调控元件P2而上调该酶的表达，所述合成调控元件P2的序列如SEQ ID NO:2所示。

10.如权利要求9所述的重组菌株WJ006，在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因的起始密码子ATG上游插入合成调控元件P2。

11.生产3-脱氢莽草酸的大肠杆菌重组菌株WJ012，其以权利要求8-10中任一项所述的重组菌株WJ006为出发菌株，通过在转酮醇酶基因（tktA）起始密码子上游插入合成调控元件P4而上调转酮醇酶（tktA）的表达，所述合成调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示。

12.如权利要求11所述的重组菌株WJ0012，通过在转酮醇酶基因（tktA）起始密码子ATG上游插入合成调控元件P4而上调转酮醇酶（tktA）的表达。

13.生产3-脱氢莽草酸的大肠杆菌重组菌株WJ038，其以权利要求11或12所述的重组菌株WJ012为出发菌株，通过上调半乳糖MFS转运蛋白（galP）的表达，和上调葡萄糖激酶（glk）的表达，和下调磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶Ⅰ（ptsⅠ）的表达。

14.如权利要求13所述的重组菌株WJ038，通过在galP起始密码子上游插入合成调控元件P1上调galP的表达，所述合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示。

15.如权利要求13所述的重组菌株WJ038，通过在glk起始密码子上游插入合成调控元件P4上调glk的表达，所述合成调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示。