[发明专利]检测耳聋基因20个突变位点的快速文库构建方法及检测方法

说明书

一种检测耳聋基因20个突变位点的快速文库构建方法及检测方法，突变位点来自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因、MT‑RNR1 12S rRNA基因；该方法包括如下步骤：使用针对突变位点的多重PCR引物对样本DNA进行目标区域扩增；在目标区域扩增产物中加入针对突变位点的分子倒置杂交探针，进行探针变性、退火反应；在恒温聚合酶、磷酸化酶和连接酶的存在下，进行延伸连接反应以将突变位点所在的缺口补齐形成单链环状文库；其中分子倒置杂交探针的两端分别与待测突变位点上下游区域互补。该方法减少反应步骤，降低建库试剂成本，缩短建库周期；采用分子倒置杂交探针，使待测突变位点位于测序读长上游50bp以内，只需要SE50测序就能稳定检测到突变位点，提高数据利用率，降低测序成本。

技术领域

本发明涉及耳聋基因检测技术领域，具体涉及一种检测耳聋基因20个突变位点的快速文库构建方法及采用所构建的快速文库进行耳聋基因突变位点检测的方法。

背景技术

耳聋是临床上最常见的遗传病之一，据2006年第二次全国残疾人调查结果显示，我国现有听力语言残疾者达2780万人，占全国总残疾人口的33.5％，其中听力残疾更是居各类残疾之首。耳聋病因复杂，但研究表明超过50％的耳聋缘于遗传因素。

耳聋相关的基因很多，但绝大部分耳聋患者是由几个单基因的缺损导致，其中最常见的耳聋基因为GJB2。GJB2基因突变在1997年首次被定位，它在儿童语前聋中占26％～33％，GJB2基因突变在亚种人遗传性耳聋中有一定的发生比例，在我国33％的语前聋为该基因导致，其中在我国突变频率最高的为234delC，其次为299_300delAT及176del16.SLC26A4，是常染色体隐性遗传性耳聋致病基因之一，占语前耳聋的8％左右，仅次于GJB2。

SLC26A4突变可以造成两种临床表现，一种是pendred综合征，表现为甲状腺肿大和耳聋；另一种在中国最为常见，患儿仅表现为耳聋，即大前庭水管综合征(enlargedvestibular aqueduct syndrome，EVAS)。SLC26A4是常染色体隐形遗传性耳聋最常见的致病基因在之一，占语前聋患儿的5％～10％。

GJB3基因突变的报道最早见于1998年，研究发现该基因的编码区538位碱基由C突变为T，导致该基因提前终止；而547位碱基由G变为A，发生了错义突变，导致183号氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸。GJB3是在我国定位和克隆的常染色体显性遗传性耳聋致病基因，被认为与高频听力下降有关，主要会引起迟发听力损失。

线粒体基因mtDNA A1555G与C1494T突变导致的耳聋主要与氨基糖苷类药物使用有关。突变携带者对氨基糖苷类药物异常敏感，低剂量使用就会出现耳鸣，甚至严重的听力下降。

现有用于耳聋基因检测的NGS文库构建方法，是用修饰有双端标签(INDEX)的引物进行多重PCR，PCR产物混合、再经过末端修复、3’端加“A”、接头连接、PCR及多步DNA纯化，操作步骤繁琐，试剂耗费大。

此外由于PCR产物具有一定长度，而待检测耳聋突变位点在PCR产物上的位置不一，为了保证测序过程中能读取到待测突变位点，往往得采用相对较长的读长策略如SE100或者PE100。一方面造成了测序数据的浪费，提高了测序成本；另一方面测序时间也更长，延长了检测周期。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测耳聋基因20个突变位点的快速文库构建方法及采用所构建的快速文库进行耳聋基因突变位点检测的方法，减少反应步骤，降低建库试剂成本，缩短建库周期；本发明采用分子倒置杂交探针，使得待测突变位点正好位于测序读长上游50bp以内，只需要SE50测序既可以稳定检测到突变位点，提高数据利用率，降低测序成本。