[发明专利]一株分泌马杜霉素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株SS0708及其应用

说明书

一株分泌马杜霉素（MD）特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株SS0708及其应用，属于免疫检测技术领域。本发明通过常规的细胞融合技术制备了一株鼠源的单克隆细胞株SS0708，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14687。该细胞株分泌的单克隆抗体采用间接竞争酶联免疫法测定，对MD的IC₅₀为3.75 ng/mL。该抗体可用于动物源食品中MD残留的免疫检测，满足目前市场上对MD快速免疫检测产品的需求。

技术领域

本发明涉及一株分泌马杜霉素（MD）特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备以及应用，涉及MD单克隆抗体的制备方法，以及动物源食品中MD的间接竞争酶联免疫检测方法的建立，属于免疫检测技术领域。

背景技术

马杜霉素（MD）又名马杜米星，是在 1983 年由 Liu 和 Labeda在微生物Actinomadura yumaensis 的发酵产物中分离得到的聚醚类离子载体抗生素的一种。马杜霉素对动物的球虫病具有用药量小、见效快和不易产生耐药性等优点，被广泛添加在畜禽饲料中。然而，这会造成马杜霉素在动物机体内残留、蓄积，食用这些动物组织可引起血管舒张，特别是诱发心脏冠状动脉扩张，引起患有冠状动脉疾病的人群的冠状动脉扩张，使病情恶化，很大程度上危害着人类的健康。我国农业部235公告中规定鸡肉中MD的最大残留标准240μg/kg。

目前，MD的最常用的检测方法为高效液相色谱法等仪器检测方法，该方法耗时长，操作需要掌握相关的专业技术，样品前处理繁琐等。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员要求低等特点，因此适用于大量样品的现场快速筛查。

发明内容

本发明的目的在于制备一种能够分泌MD特异性单克隆抗体的细胞株制备方法，建立检测MD的免疫学检测方法。

本发明的技术方案：一株分泌马杜霉素MD特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株SS0708，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14687。

马杜霉素特异性单克隆抗体，其是由所述保藏编号为CGMCC No.14687的杂交瘤细胞株SS0708分泌产生，其IC₅₀为3.75 ng/mL。

所述马杜霉素特异性单克隆抗体的应用，用于动物源食品中MD残留的免疫检测。

提供的MD杂交瘤细胞株的制备方法基本步骤为：

（1）免疫原和包被原的制备：采用活化酯法，将MD与载体蛋白KLH偶联得到的MD-KLH作为免疫原，将MD与载体蛋白OVA偶联得到的MD-OVA作为包被抗原。具体合成步骤如下：步骤1： 称取10mg MD，溶于3 mL 0.1 M pH 6.0的一水合 2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）溶液中；不断搅拌下，先加入24mg N-羟基琥珀酰亚胺，15 min 后，再加入31mg 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基-碳二亚胺）；在室温下，搅拌2h，得到活化液；步骤2：称取20mg KLH 或者OVA，溶于1mL 0.1 M pH 9.0碳酸盐缓冲溶液中；在不断搅拌下，逐滴加入活化液，室温下，反应4h后，将反应液用0.01 M pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析，即可得到MD-KLH或者MD-OVA。

（2）动物免疫与效价测定：采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c 雌性小鼠，首次免疫用100μg MD-KLH与等量弗氏完全佐剂混匀后进行皮下注射，间隔3周后，再用100μgMD-KLH与等量弗氏不完全佐剂加强免疫，此后每隔3周用半量MD-KLH加强免疫一次；冲刺免疫剂量减半，与等体积的生理盐水混合后采用腹腔免疫，用MD与鸡蛋清白蛋白（OVA）的偶联物MD-OVA作为包被抗原，通过间接竞争ELISA检测血清效价和抑制；

其具体ELISA 程序如下：

1)包被：将包被抗原用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液梯度稀释，100μL/孔，37℃孵育2h；