[发明专利]一种高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基

说明书

技术领域

本发明属于黑松体胚发生技术领域，具体涉及一种高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基。

背景技术

松材线虫病(Bursaphelenchus xylophilus)是松树上的一种毁灭性传染病，被许多国家列为检疫对象。我国1982年首次在南京中山陵发现，现已扩散到苏、皖、浙、赣等16个省(市)的246个县(区)。每年发生面积达10万公顷，直接经济损失25亿元(叶建仁，2010)。近年来其在我国的扩散趋势越来越明显，现已成为我国一种重要入侵病原生物(宁眺等，2004)。黑松是松材线虫病的高度感病树种，在我国山东、安徽、浙江、福建、江苏等省均有种植，全国总面积约159 300hm²。我国黑松林的健康发展受到松材线虫病的严重威胁。2004年，本团队从日本引进了一批珍贵的抗松材线虫病黑松种质资源，并建立了抗病黑松优良家系基因资源库(吴小芹等2009)。由于基因库中的母树种子产量有限，并且受到季节、环境等条件的限制，所以本实验室2008年开始了抗性黑松体细胞胚胎发生的研究，并先后成功诱导抗性黑松胚性细胞团，建立抗性黑松体胚发生体系(孙婷玉等，2014，2015)。目前该体系仍存在体胚发育不一致、产胚率低的问题，需要进一步优化。

体细胞胚胎发生是一个复杂的过程，大量研究表明，基本培养基的成分对松属树种的分化至关重要，其中培养基添加剂聚乙二醇(PEG)、活性炭(AC)、脱落酸(ABA)、糖种类及浓度对体细胞胚的成熟发育起着至关重要的作用。脱落酸(ABA)能促进体胚的成熟，抑制裂生多胚以及畸形胚的产生。采用活性炭(AC)对湿地松ESM进行成熟预处理，再将其转入成熟培养基中，获得了早期子叶胚(吴丽君，2009)。ABA与AC组合促进了马尾松子叶胚的形成(黄健秋，1995)。松属树种体胚的成熟还需要高渗透压的刺激作用，通常使用PEG作为渗透剂来提高培养基的渗透压，没有PEG调节培养基渗透压，几乎不可能获得子叶胚(Uddin,1993)。糖除了可以作为ESM的碳源外，也是重要的渗透剂，体细胞胚成熟阶段使用适当浓度的糖，不仅可以促进体胚的发生还能有效抑制畸形胚的出现，另外糖的种类对体胚的发育也十分重要，目前研究发现，麦芽糖对体胚的成熟的作用要大于其他种类的糖(Bozhkov,et al.2002)。因此要获得优良的成熟体细胞胚，只有在各种培养基组分都适合体细胞胚成熟的条件下才能实现。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基，能有效提高抗性黑松体细胞胚的数量和质量。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基，配方为：DCR，麦芽糖30～45g/L，ABA 5-10mg/L，PEG8000 100～125g/L，AC 2g/L，植物凝胶3g/L。

所述的高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基，所述的麦芽糖45g/L，PEG8000 125g/L。

所述的高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基，所述的ABA10mg/L，PEG 100g/L。

所述的高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基，所述的麦芽糖45g/L，ABA 10mg/L，PEG8000 125g/L。

所述的抗松材线虫病黑松得胚性细胞系为#1337，培养基为DCR+麦芽糖45g/L+ABA 10mg/L+PEG 125g/L。

所述的抗松材线虫病黑松得胚性细胞系为#1537或#1637，培养基为DCR+麦芽糖30g/L+ABA 10mg/L+PEG 125g/L。

所述的高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基在高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生中的应用。

所述的应用：胚性细胞在固体增殖培养基上继代生长10天，取1g胚性胚柄细胞团于30mL培养液中，培养采用100mL的三角瓶，置于90rpm摇床上，25℃，暗培养，每星期继代增殖一次至胚性细胞全部均匀分散于培养液；将继代4次的胚性细胞充分摇匀，取2mL胚性细胞喷洒在无菌滤纸，平铺在固体成熟培养基上。