[发明专利]基于点击化学的测序接头、双条形码测序文库及其构建方法

说明书

一种基于点击化学的测序接头、双条形码测序文库及其构建方法，该测序接头包括：日期片段，包括5’端的与正向引物部分或全部序列一致的序列、中间的日期条形码序列以及3’末端的点击化学反应基团；样本片段顶链，包括5’末端的点击化学反应基团、中间的样本条形码序列以及3’端的与反向引物部分或全部序列一致的序列；样本片段底链，包括5’末端的磷酸化修饰、中间的样本条形码序列；其中样本片段底链分别与日期片段和样本片段顶链部分杂交；杂交后日期片段的点击化学反应基团与样本片段顶链的点击化学反应基团位置接近且能发生点击化学反应而偶联。可以快速、高效地实现双条形码测序文库构建，通过测序推断出核酸文库构建的日期，实现准确的样本溯源。

技术领域

本发明涉及测序技术领域，具体涉及一种基于点击化学的测序接头、双条形码测序文库及其构建方法。

背景技术

分子生物学技术为感染性疾病病原微生物的诊断提供了新的手段，特别是PCR技术的高度敏感性和特异性，使感染性疾病的诊断有了质的飞跃。它可以从分子水平上早期诊断各种感染性疾病，并根据基因序列判断疾病的发生、发展、变异等。由于PCR检测高度的敏感性，使得病原检测极易出现假阳性，因此污染防控是基于PCR扩增的分子诊断产品的重要组成部分。

测序是确定微生物最为准确可靠的方法之一，使用新一代测序平台对提取的DNA进行测序，通过得到的大量序列信息，利用现有的微生物基因信息数据库，可以迅速识别各类病原微生物，使诊断结果更加精确。全基因组测序技术不同于以往的微生物分析手段，不需要筛选得到该环境中所有微生物的纯培养物，就可以一次性发现所有微生物的种类和生存情况，可以避免环境改变带来的偏差。如果将这种诊断技术应用于临床，可以判断已知和预测未知病原体，将极大提高病原微生物检测的效率和准确性，也可以在微量的样本中检测出病原体，尤其是发现部分先前未鉴定的微生物。随着高通量测序技术的快速发展和成本的降低，使得这一技术有了巨大的应用前景，但其面临着与PCR技术一样的问题，测序文库容易受到外源核酸的污染。如何高效地解决这一问题是高通量测序技术在临床大规模应用的前提。

现有高通量病原检测技术流程包括：样本核酸提取；Qubit测定核酸浓度；核酸片段化；末端修复与纯化；接头连接；测序引物PCR扩增；文库片段选择；Qubit测定文库浓度及质控；以及上机测序及结果分析。现有高通量测序文库构建过程较易产生气溶胶，污染其它样本，导致检测假阳性的产生；现有测序文库构建过程较为繁琐，样本编号系统不统一，依靠试管上的标识容易弄错或磨损，操作过程一旦出现失误，无法追踪样本的来源信息；对测序样本无法进行日期等核心信息的有效识别。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于点击化学的测序接头和包含此接头的试剂盒，以及利用基于点击化学的测序接头进行建库的方法及基于此建库方法构建的文库。利用本发明的测序接头，可以快速、高效地实现双条形码测序文库构建，通过测序推断出核酸文库构建的日期，实现准确的样本溯源，可排除测序结果中非当日产生的核酸序列，排除气溶胶污染。

为了解决上述问题，本发明通过如下技术方案实现:

本发明第一方面提供一种基于点击化学的测序接头，该测序接头包括如下三条核酸序列片段：

日期片段，其包括5’端的与正向引物部分或全部序列序列一致的序列、中间的用于编码日期信息的条形码序列以及3’末端的用于进行点击化学反应的基团；

样本片段顶链，其包括5’末端的与上述日期片段的3’末端基团进行点击化学反应的基团、中间的用于区分样本的条形码序列以及靠近3’端的与反向引物部分或全部序列序列一致的序列；

样本片段底链，其包括5’末端的用于与待测序核酸片段连接的磷酸化修饰、中间的用于区分样本的条形码序列，该条形码序列与上述样本片段顶链中的条形码序列反向互补；