[发明专利]一种甘露聚糖酶的工业发酵方法

权利要求书

1.一种甘露聚糖酶的工业发酵方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1：一级发酵罐发酵

在一级发酵罐中装入一级发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对一级发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将毕赤酵母发酵种子液以体积比为5-10％的接种量移种到一级发酵罐中扩大培养，向发酵罐中补加微量元素溶液，微量元素溶液和发酵培养基的体积比为1：20-25；发酵种子液接种量为1.5-2％；一级发酵罐转速为180-200rpm；培养温度为29-32℃；当一级发酵罐中的发酵液的残糖低于3-3.5g/L或者湿重≥55-60g/L时，停止；通风量，0-6h为45-50m³/h，6h-结束为65-70m³/h；一级发酵罐罐压控制在0.03-0.08Mpa；

步骤2：二级发酵罐发酵

在二级发酵罐中装入二级发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对二级发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将一级发酵罐培养的菌体以体积比为10-15％的接种量移种到二级发酵罐中扩大培养，二级发酵罐培养为恒温培养，培养温度为29-32℃，二级发酵罐转速为180-200rpm，当二级发酵罐中的发酵液的湿重≥80g/L时停止；通风量，0-6h为550-650m³/h，6h-结束为850-950m³/h；所述二级发酵罐培养过程中发酵液的pH为4.5-4.6；二级发酵罐罐压控制在0.03-0.08Mpa；

步骤3：高密度发酵

在高密度发酵罐中装入发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对高密度发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将二级发酵罐培养的菌体以体积比为10-13％的接种量移种到高密度发酵罐中扩大培养，高密度发酵罐培养为恒温培养，高密度发酵罐转速为120-140rpm；从发酵起始24小时内用氨水控制发酵液的pH值在4.5-4.7，直至溶解快速反弹至80％时停止；培养温度控制在29-32℃；通风量：0h-4h，1500-1600m³/h；大于4h：2200-2400m³/h；高密度发酵罐压控制在0.03-0.08Mpa；

步骤4：补料发酵

向高密度发酵罐中补加料液；

在0-2h小时内，以300-350L/h的速度流加料液；

在2-4h小时内，以500-550L/h的速度流加糖液；在4小时以后，以650-700L/h的速度流加料液；补料发酵整个过程中，当DO低于25％时，降低各时段内料液流速20％；DO低于20％时，则停止料液流加，直至溶氧回升；当发酵液的菌体湿重达到190g/L时，停止流加；

每吨料液中含有葡萄糖55-70kg、30％浓度的甘油15-20kg，NH₄H₂PO₄ 5-7kg、K₂SO₄ 10-15kg、MgSO₄ 4-9kg、CaSO₄ 0.8-1.5kg、KOH 0.3-0.6kg，其余为水；

步骤5：饥饿

停止补料后，不补加任何碳源，观察DO回升至80％，pH值回升0.2-0.3时停止；

步骤6：诱导、混饲

0-1h按40L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；1-2h按45L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；2-3h按50L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；3-5h按65L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按7:1体积比的混合液；5-7h按80L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按6:1体积比的混合液；7-9h按95L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按5:1体积比的混合液；9-11h按110L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按4:1体积比的混合液；11-13h按120L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按3:1体积比的混合液；13-19h按130L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按2:1体积比的混合液；19-22h按140L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按1:1体积比的混合液；

22h后，按145L/h的流速向高密度发酵罐中流加盐溶液和甲醇按1:4体积比的混合液并根据发酵液的吨位和溶氧量调节转速、空气流量以及混合液流速，具体为：控制溶氧在20％以上，当溶氧升至60％时，将混合液流速加大20％，如不能保持溶氧在20％以上，则停止混合液流加，直至溶氧回升；

其中盐溶液的配方为：

CuSO₄·5H₂O 3-3.8g、NaI0.03-0.08g、MnSO₄·H₂O1.5-2g、H₃BO₃ 0.01-0.03g、Na₂MoO₄.2H₂O 0.1-0.3g、CoCl₂0.2-0.5g、ZnCl₂ 10-16g、FeSO₄·7H₂O30-45g、H₂SO₄ 2.5-3g、生物素0.2-0.3g；当直至发酵液中湿菌重达到180g/L时，流加甘油进行混饲，混饲流速为40-60L/h；诱导开始后90-110h停止混饲；甘油的浓度为10-15％；

诱导不低于160-170h后，结束发酵。