[发明专利]一种结合AUDG和自避分子识别系统的环介导恒温扩增方法

说明书

本发明公开了一种结合南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶(AUDG)和自避分子识别系统(SAMRS)的环介导恒温扩增方法，所述方法对环介导恒温扩增中的引物3’端倒数第二位碱基至倒数第五位碱基的4个碱基进行SAMRS修饰，并在引物LF的5’端标记半抗原，在扩增系统中引入AUDG酶、脱氧尿嘧啶和生物素化的脱氧胞嘧啶，以环介导恒温扩增技术为基础，结合高分子纳米生物传感检测扩增产物。所述方法针对结核分枝杆菌复合群的IS6110特异序列的扩增产物能被高分子纳米生物传感器可视化检测。所述方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于各种核苷酸片段检测。

技术领域

本发明公开了一种环介导恒温扩增检测微生物目的基因的方法，属于微生物和分子生物学技术领域。

背景技术

在现代生物学和医学领域，核酸扩增是一种不可缺少的技术，已经广泛运用于基础研究、临床诊断、考古研究、流行病研究、转基因研究等领域。在已经发展的核酸扩增技术中，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是第一个被建立的体外核酸扩增技术，具有划时代意义，该技术现已被广泛运用于生物相关领域。然而，PCR技术进行核酸扩增时，受到实验室条件的限制，依赖于复杂昂贵的热循环设备。除此之外，PCR产物的检测比较复杂，需要一套复杂的流程及设备。这些劣势限制了该技术的广泛应用，尤其在经济落后的地区及快速诊断领域。因此，对于生物及医学相关研究领域而言，非常有必要发展简单、快速、敏感的核酸扩增方法。为了克服PCR扩增技术的劣势，应运而生了许多恒温扩增技术。与PCR技术比较，恒温扩增技术不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增、现场诊断及便捷检测。到目前为止，已发展的恒温扩增技术有10余种，应用较为广泛的有环介导恒温扩增(LAMP)、交叉扩增(CPA)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)等。在这些恒温扩增技术中，最流行的技术为环介导恒温扩增。LAMP在恒温条件下实现核酸扩增，仅使用一种恒温置换酶、扩增速度快、反应灵敏、特异性高。

环介导恒温扩增(LAMP)的技术瓶颈在于结果的判读，即扩增产物的检测。到目前为止，最常见的产物检测手段主要包括颜色指示剂、电泳、实时浊度。然而，这三种检测技术仅仅适用于单一检测(即单一靶标的检测)。此外，颜色指示剂判读扩增产物时，会出现模拟两可的结果，电泳判读结果时耗时较长，容易出现交叉污染，不适合于现场检测，实施浊度判读时需要特殊的仪器设备。为了克服这三种检测技术的劣势，使LAMP技术在生物、医药及卫生领域应用更广泛、更经济。近期，发明人以LAMP技术为基础，将LAMP技术与纳米生物检测技术相结合，开发了依赖LAMP技术、实现快速、敏感检测的纳米生物传感技术，该技术被命名为环介导恒温扩增结合金纳米生物传感的核酸诊断技术(Loop-mediated IsothermalAmplification Label-based Gold Nanoparticles Lateral Flow Biosensor,LAMP-LFB)，相关内容公开于CN201610576270.6，该专利文件作为现有技术文件构成本申请说明书的一个部分。

为了将LAMP扩增产物适用于纳米传感技术，传统的策略是在LAMP扩增体系中同时添加两条标记的引物，一条引物在5’端标记生物素，另一条引物在5’端标记半抗原。当LAMP扩增完毕，双标的扩增产物被构建(该双标的产物起源于两条标记的引物)，一端标记生物素，另一端标记半抗原。然而，传统策略构建双标记的LAMP产物容易导致假阳性结果，甚至不需要扩增就能导致假阳性结果。该假阳性结果来源于标记引物之间的杂交。因此，为了克服传统标记策略的劣势，本发明设计了一种新的检测策略，该技术只需一条标记的引物就能构建双标的扩增产物，从而将扩增产物适用于生物传感技术。