[发明专利]一种口含型烟草制品对牙龈卟啉单胞菌影响的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种口含型烟草制品对牙龈卟啉单胞菌影响的检测方法。

背景技术

据全国第三次口腔健康流行病学调查结果显示，慢性牙周炎(chronic period ontitis，CP)的患病率达到80％以上，而且是35岁以上人群牙齿缺失的主要原因。现代医学研究表明，慢性牙周炎多是由于患者口腔卫生环境差，咬合创伤等因素引起的牙周组织渐进性破坏，初期多表现为口臭、牙龈红肿、出血，久之不治疗则会导致牙齿松动、牙槽骨破坏、甚至是拔牙，此外它还关系到心、肺、肾等重要脏器的功能。牙周组织损害与多种龈下微生物有关，其中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis)被认为是慢性牙周炎最重要的致病菌之一，该菌常在牙周炎患者龈下菌斑和唾液中检出，在牙周健康人群中也能检测到。牙龈卟啉单胞菌具有脂多糖、荚膜多糖、菌毛、牙龈蛋白酶等一系列致病因子，能够成功侵袭宿主细胞，并逃避免疫系统。

口含型无烟气烟草制品是一种湿润的烟草粉末制品，起源于19世纪瑞典。瑞典口含烟产品呈现细的颗粒状，含水量通常在40％以上，含水量低于40％的半干制品也有售。产品放在上唇与牙龈之间，使用时不需要唾出唾液，有散装和袋装产品。在产品使用的过程中，产品对人口腔健康的影响是一个重要考察指标。目前的烟草制品仅针对产品本身进行一些物理化学指标的检测，而对人口腔中的微生物影响研究较少，尤其是针对口腔中牙龈卟啉单胞菌的研究未曾涉及。因此如何克服现有技术的不足是目前生物检测技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种口含型烟草制品对牙龈卟啉单胞菌影响的检测方法，该方法首先配制含有牙龈卟啉单胞菌的人工唾液，并针对口含型产品的使用特点，采用人工唾液模拟口含型烟草制品的使用过程，并对唾液的牙龈卟啉单胞菌含量进行荧光定量PCR分析，从而考察在使用口含型烟草制品前后唾液中的牙龈卟啉单胞菌含量的变化，为口含型烟草制品的口腔健康提供参考。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种口含型烟草制品对牙龈卟啉单胞菌影响的检测方法，包括如下步骤：

步骤(1)，配制人工唾液，并向人工唾液中添加牙龈卟啉单胞菌，使牙龈卟啉单胞菌在人工唾液中的量为1*10⁴-1*10⁶CFU/mL，得到含牙龈卟啉单胞菌的人工唾液；

步骤(2)，采用步骤(1)得到的含牙龈卟啉单胞菌的人工唾液对口含烟烟草制品进行提取，提取多次，分别收集提取液；

步骤(3)，将步骤(2)收集到的各提取液与步骤(1)的含牙龈卟啉单胞菌的人工唾液一起放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养；之后分别提取各培养液中的牙龈卟啉单胞菌DNA，同时提取牙龈卟啉单胞菌的标准菌株原始DNA；

步骤(4)，以浓度梯度稀释10倍的牙龈卟啉单胞菌的标准菌株原始DNA 作为模板进行荧光定量PCR分析，之后绘制牙龈卟啉单胞菌荧光定量PCR标准曲线；

同时，分别以各培养液中的牙龈卟啉单胞菌DNA作为模板进行荧光定量P CR分析，空白对照模板采用灭菌双蒸水，根据标准曲线计算各培养液中的牙龈卟啉单胞菌DNA的含量；

其中，荧光定量PCR分析所使用的上游引物为5’-tacccatcgtcgccttggt-3’；下游引物为5’-cggactaaaaccgcatacacttg-3’；探针为FAM-atttatagctgtaagatagg c-TAMRA。

进一步，优选的是，步骤(2)的具体方法为：

向口含烟烟草制品0.8-1.2g中注入步骤(1)的含牙龈卟啉单胞菌的人工唾液于37℃下恒温震荡进行提取，提取多次，每次提取所用的含牙龈卟啉单胞菌的人工唾液10mL，每次提取时间为5min，分别收集提取液。

进一步，优选的是，所述的震荡速度为150-300rpm；提取次数为3次。

进一步，优选的是，步骤(3)的具体方法为：

(3.1)共培养：取步骤(2)收集到的各提取液与步骤(1)的含牙龈卟啉单胞菌的人工唾液，每种液体均分为3等份，分别放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养，每种液体3等份的培养时间分别为0h、2h、6h三个时间段；