[发明专利]一种卷烟烟气对细胞水渗透性影响的检测方法

权利要求书

1.一种卷烟烟气对细胞水渗透性影响的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），采用用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用DMEM/F12细胞培养基浸润该装置的模拟人工口腔黏膜内壁；选取10-20支重量和吸阻一致的烟支作为待检测样品，平衡后进行抽吸，抽吸结束后，取出仿生吸收装置的瓶体中的液体，得到仿生抽吸液体；

所述的用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，包括用于烟气暴露吸收的瓶体、烟气捕集器和真空泵；所述瓶体的内壁设置模拟人工口腔黏膜内壁并浸润有人工唾液，其下部设置有连通瓶体的烟气进气管，上部设置有连通瓶体的大气连接管及烟气排出管；所述烟气进气管用于卷烟的夹持，且其上设置有第一阀门；所述大气连接管上设置有第二阀门；所述烟气排出管上设置有第三阀门，并通过管道依次连接烟气捕集器和真空泵；

步骤（2），将涎腺腺样囊性癌细胞经0.25%胰酶消化后，以2×10⁴-4×10⁴个/mL细胞浓度接种于含有DMEM/F12细胞培养基的细胞培养板上，在37℃、5%CO₂的条件下培养22-26h后，加入骨形成蛋白6至终浓度为6ng/ml，处理2-3d；

步骤（3），移去步骤（2）中的培养上清，以步骤（1）得到的仿生抽吸液体稀释4-8倍后的液体作为培养基继续在37℃、5%CO₂的条件下对细胞进行培养22-26h；

步骤（4），培养结束后弃上清，加入含10μM荧光钙黄绿素的DMEM/F12细胞培养基，室温孵育9-11min；

步骤（5），弃上清，将细胞置于150 mOsm低渗液中进行处理9-11min，再换成等渗液，用高内涵成像系统对细胞进行FTIC通道的扫描，设置为每5-10s扫描一次，扫描多次；

步骤（6），使用高内涵分析软件对步骤（5）所得到的图片进行分析，计算不同时间点扫描图片的平均细胞荧光面积；之后按以下公式计算调节性容积回缩值RVD：

RVD(%)=（Vmax- Vmin）÷（Vmax-V0）×100 式（Ⅰ）

式（Ⅰ）中，V0为等渗状态下平均细胞荧光面积；Vmax为低渗状态下最大平均细胞荧光面积；Vmin为低渗状态下平均细胞荧光面积；

所得到的调节性容积回缩值即表征该检测样品烟气对细胞水渗透性。

2.根据权利要求1所述的卷烟烟气对细胞水渗透性影响的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述的平衡条件为：温度22±1℃，湿度60±2%，时间48h。

3.根据权利要求1所述的卷烟烟气对细胞水渗透性影响的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述的抽吸采用全自动转盘式吸烟机。

4.根据权利要求1所述的卷烟烟气对细胞水渗透性影响的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述的抽吸的抽吸频率为1口/min，抽吸持续时间为2s，抽吸容量为35mL±0.15mL/口。

5.根据权利要求1所述的卷烟烟气对细胞水渗透性影响的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，浸润模拟人工口腔黏膜内壁所用的DMEM/F12细胞培养基的量为5-10mL。

6.根据权利要求1所述的卷烟烟气对细胞水渗透性影响的检测方法，其特征在于，所述的细胞培养板为96孔板。

7.根据权利要求1所述的卷烟烟气对细胞水渗透性影响的检测方法，其特征在于，步骤（5）中扫描总时间为10min。

8.根据权利要求1所述的卷烟烟气对细胞水渗透性影响的检测方法，其特征在于，每个样品检测均重复三次，结果取三次检测的平均值。