[发明专利]一种组织来源外泌体的提取方法及应用

权利要求书

1.一种组织来源外泌体的提取方法，其特征在于，所述的方法基于酶裂解组织后直接进行外泌体提取，所述的方法包括以下步骤：

步骤一、将组织用机械法剪碎后加入胶原酶和Dnase酶进行裂解；

步骤二、对裂解后的混合液使用PEG法进行外泌体提取操作。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一为以下步骤：

(1)新鲜组织直接置于冷的1640培养液中，用机械法将组织破碎；

(2)加入的胶原酶和Dnase酶裂解组织为细胞悬液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一为以下步骤：

(1)冷冻的组织迅速置于37℃水浴锅中回温，之后置于冷的1640培养液中，用机械法将组织破碎；

(2)加入的胶原酶和Dnase酶裂解组织为细胞悬液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二为以下步骤：

(1)将混合液3000g 4℃离心30min后将上清转移到新的离心管，13000g 4℃离心10min取上清；

(2)将上述上清通过过滤膜进行过滤，进一步去除上清液中的细胞残片及其他杂质；

(3)将滤过液与PEG溶液按照1:1比例混合，颠倒混匀，4℃孵育过夜；

(4)第二天13000g 4℃离心30min，弃上清；留沉淀再次13000g 4℃离心5min，小心吸走残余上清，沉淀即为外泌体。

5.根据权利要求2或3任一所述的方法，其特征在于，所述胶原酶为0.5mg/ml的IV型胶原酶，Dnase酶为0.2％(w/v)的Dnase I。

6.根据权利要求2或3任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)为：加入的胶原酶和Dnase酶裂解组织为细胞悬液，裂解体系在摇床上孵育90min，每30min用移液枪轻柔吹打1min。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述过滤膜孔径为0.22μm的混合纤维素滤膜。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PEG溶液为16％(w/v)PEG6000溶液。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

(a)将新鲜的组织块置于预冷的350μl 1640培养基中；

(b)用锋利的刀片将组织块切碎为1mm³大小，冰上操作；

(c)加入350μl浓度为1mg/ml胶原酶IV和2μl浓度为0.2％(w/v)Dnase I，将枪头尖锐部分剪去，轻柔吹打混合液；

(d)将以上混合液置于恒温摇床37℃ 100rpm消化90min，直至组织块肉眼不可见后终止消化，将样本收集置于4℃条件下延缓其消化；

(e)待所有的组织块完全消化完毕后转移到试管中，3000g 4℃离心30min，吸取上清，转移到新的离心管，13000g 4℃离心10min，收获上清；

(f)将上清通过0.22μm的滤器，将滤过液转移到新的离心管，13000g 4℃离心10min，收上清；

(g)将上清与PEG6000(16％w/v)按照1：1比例混合，颠倒混匀，4℃孵育过夜；

(h)第二天，13000g 4℃离心30min，吸、弃上清；再将沉淀13000g 4℃离心5min，小心吸走残余上清，所得沉淀即为纯化的组织外泌体。