[发明专利]一种黄牛KCNJ12基因CNV标记辅助检测生长性状的方法及其专用试剂盒

说明书

本发明公开了一种黄牛KCNJ12基因CNV标记辅助检测生长性状的方法及其专用试剂盒：基于实时荧光定量PCR技术，以郏县红牛的血液全基因组DNA为模板，利用特异引物P1扩增牛KCNJ12基因的拷贝数变异区域，同时利用另外一对特异性PCR引物R1扩增郏县红牛BTF3基因作为对照，然后利用2^‑ΔΔCt的计算结果判定个体的拷贝数是否有缺失。本发明提供的方法建立在郏县红牛KCNJ12基因拷贝数缺失与生长性状之间的关联性基础之上，有利于加快黄牛分子标记辅助选择育种工作，方法简单、快速，便于推广应用。

技术领域

本发明属于分子遗传学研究领域，具体涉及一种黄牛KCNJ12基因CNV标记辅助检测生长性状的方法及其专用试剂盒，该方法利用基因组DNA实时荧光定量PCR，以BTF3基因为参照，根据2^-ΔΔCt值从而确定个体的拷贝数变异，在KCNJ12基因拷贝数变异与生长性状之间的关联性基础之上，加快黄牛分子标记辅助选择育种工作。

背景技术

随着基因组学和生物信息学等相关学科的迅猛发展，动物遗传育种的理论和技术也发生了重大的变化，肉牛的育种也由传统的常规表型选育转向分子选育，目前，分子育种的研究主要集中在标记辅助选择(molecular mark-assist selection,MAS)，该技术是通过DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

拷贝数变异(Copy Number Variations,CNVs)是指基因组中大于50bp的片段插入、缺失复制和复杂的重组的现象，是一种在基因组亚显微水平上的结构变异，可以通过剂量效应、位置效应、阻断功能基因、融合基因、暴露隐性等位基因和潜在的跃迁效应来影响基因的功能以及个体的表型。研究表明，有些CNV位点位于功能基因的内部，与畜禽的生长性状有相关关系，或与QTL位点重合，对经济性状的一定影响。

目前，CNV常用的检测方法主要分为两类：一类主要用于在全基因组范围内检测未知CNV，包括基因组芯片和高通量测序技术；另一类主要用于定点检测或验证已知CNV。其中芯片方法主要包括比较基因组杂交芯片(Comparative GenomicHybridization,CGH)和SNP芯片，在比较基因组芯片中寡核苷酸探针芯片因其具有高精度、高灵敏度、样本需要量小等特点，被广泛使用。SNP芯片在检测时不需要对照样本，通过被检测样本内SNP信号强度来进行分析。其主要优点是能同时提供拷贝数和基因型信息，还可以显示杂合性缺失。但是SNP芯片上的探针在基因组分布不均衡，很多复杂区域探针设计困难。因此，SNP芯片在检测CNV时有一定的局限性。随着新一代测序技术的成熟，直接通过重测序来检测基因组结构变异已经成为当前最有效的检测手段。与杂交技术相比，利用测序技术来检测CNV具备很多优势，如提高了CNV的分辨率、可以确定CNV的边界、可以检测出个体CNV的绝对拷贝数，对于结构变化复杂的CNV也有较高检测效力，但这种方法成本较高。

对于已确定的CNV的检测，通常是采用基于PCR技术和杂交技术的一些方法。例如QPCR、QMPSF、MLPA、FISH、Southern blotting和MAPH等。其中，实时荧光定量PCR(QPCR、qRT-PCR)最为常用。根据qRT-PCR所使用的荧光化学方法的不同，主要分为荧光染料嵌入法和荧光杂交探针法两类。PCR反应体系中加入过量的SYBR Green染料分子，能特异性地渗入DNA双链并发射荧光信号，而游离的染料分子则仅有很低的荧光本底，几乎不发光，从而确保信号的增加与PCR产物的增加同步，可通过检测荧光信号的强度来反映基因组DNA的数量。通过对目的基因(具有拷贝数变异)及参考基因(无拷贝数变异)进行相对定量，根据2^-ΔΔCt方法统计检测样本候选基因的拷贝数。染料法的优点是实验成本低、无需设计合成探针、使用方便，可以检测目的片段的绝对拷贝数，但不适用于大样本的高通量检测。