[发明专利]一种多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂缓冲液及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学临床分子检测领域，具体涉及一种应用于荧光PCR平台的多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂的缓冲液及其应用。

背景技术

RT-PCR（reverse transcription PCR，逆转录PCR，或称为反转录PCR），是聚合酶链式反应的一种广泛应用的变性。在RT-PCR过程中，一条RNA链被逆转录称为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。RT-PCR的关键步骤是RNA的反转录，要求RNA模板为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成随细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia virus，MMLV）反转录酶。

RT-PCR通常有一步法RT-PCR和两步法RT-PCR两种方法，一步法RT-PCR操作简便，RT和PCR之间无需开管，能够减少污染的可能性，RT过程得到的cDNA产物全部用于PCR扩增，使得一步法的灵敏度更高，但是单管反应是RT和PCR都不能够在最佳反应条件下进行并且容易相互干扰；两步法RT-PCR方法种，RT和PCR分别在最优的条件下进行使两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活且严谨，适合对付未知模板或者较为困难的模板。

PCR反应增强剂和稳定剂常见的有：二甲亚砜(DMSO)、甘油、牛血清白蛋白(BSA)、甲酰胺、非离子去污剂、聚乙二醇6000、亚精胺、硫酸铵、甜菜碱(Betaine)和海藻糖（Trehalose）中的一种或多种，它们对PCR反应的影响虽然有所不同，但都可提高PCR的扩增效率。其中，1％-10％二甲亚砜能改变引物模板配对反应的熔解温度，从而改善GC含量高的DNA的变性情况，使聚合酶更容易在二级结构处延伸，但当浓度高时（大于10％）时会降低保真性。5％-20％甘油可提高产量，增加酶的稳定性。0.1μg/μl-1μg/μl牛血清白蛋白能提高PCR反应的效率，同时减少体系中PCR抑制物对反应的影响。1.25％-10％甲酰胺可促进某些“引物-模板”退火，降低带有二级结构的DNA的变性温度。硫酸铵能增加反应体系的离子强度，改变DNA的变性及退火温度，调节酶活。0.5-2M甜菜碱有助于高GC含量和长DNA片段的PCR反应。2%-5%海藻糖可作为PCR增强剂，通过降低DNA双链融解温度，维持Taq DNA聚合酶稳定性，提高PCR反应效率，可作为酶稳定剂，维持酶的活性及热活化后的酶活性。可中和抑制剂对DNA聚合酶的抑制作用，维持PCR扩增效率。可以根据实际需要，选择其中的一种或多种。

发明内容

本发明提供了一种多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂缓冲液，以一步法RT-PCR为方法基础，针对可能的影响因素采取相应的措施，设计了一种RT-PCR缓冲液。

本发明特征在于：优化了RT-PCR实验PCR反应缓冲液，特别是加入了一定剂量的PCR反应增强剂DMSO、稳定剂海藻糖。对于一步法RT-PCR反应中的逆转录反应效率和DNA扩增检测反应效率有很大程度的提高，能够同时满足RNA逆转录反应和荧光PCR反应的高效率进行。

本发明提供一种多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂缓冲液，包括Tris盐、硫酸铵、氯化镁和氯化钾的水溶液，所述缓冲液pH值为8.0~10.0，所述缓冲液中Tris盐、硫酸铵、氯化镁和氯化钾的浓度分别为50~100mM、10~50mM、1.0~5.0mM和25~100mM。更优选的，所述缓冲液pH值为9.2，所述缓冲液中Tris盐、硫酸铵、氯化镁和氯化钾的浓度分别为75mM、20mM、3mM和80mM。

本发明提供一种多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂缓冲液，还包括PCR反应增强剂二甲基亚砜和稳定剂海藻糖，所述缓冲液中二甲基亚砜和海藻糖溶质百分数分别为1~10%和2~5%。更优选的，所述反应液中二甲基亚砜和海藻糖的溶质百分数分别为2%（v/v）和4%（m/v）。

本发明提供一种多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂缓冲液，所述缓冲液在多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂中的应用，所述方法包括：

（1）配制10×所述缓冲液

配制10×RT-PCR Buffer，包含Tris盐750mM、硫酸铵200mM、氯化镁30mM、氯化钾800mM、海藻糖40%（m/v）、二甲基亚砜20%（v/v）、Tween-20 1‰（v/v）、以及ddH₂O。

（2）引物探针的设计

将设计好的引物及探针序列交由合成公司合成，一般采用仪器自动化学合成，需提供合成检验合格报告