[发明专利]一种端粒探针及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种端粒探针及其制备方法和应用，该端粒探针为在CdSSe/ZnS量子点表面偶联了单链DNA，该端粒探针可以通过原位杂交技术结合到细胞端粒，用单分子定位技术对杂交了端粒探针的端粒进行成像，实现对端粒的检测。本发明实现了端粒的特异性标记，利用单分子定位显微镜成像，分辨率更高，克服了荧光显微技术的受光学衍射极限限制的缺点，利用本发明可以实现对端粒结构的进一步研究。

技术领域

本发明涉及DNA探针及其制备方法和应用，特别涉及一种端粒探针及其制备方法和应用。

背景技术

端粒是真核生物染色体末端的一种特殊结构，其序列中是富含G核苷酸的串联重复序列。染色体DNA末端膨大成粒状，像帽子那样盖在每条染色单体的两端，因此，每对染色体有2个染色单体和4个端粒。该结构和染色体断裂形成的末端存在许多差异，如不能相互融合，而且只有当染色体末端结构完整时，细胞才能复制。在脊椎动物中端粒序列是由TTAGGG重复序列及其互补序列构成的双链结构，并且其中一条单链的3’悬突于外，构成了一种由数百个碱基组成的悬突结构。这个悬突结构再通过折叠作用与双链形成一个环状结构(T环，t-loop)，对染色体末端起到保护作用。在DNA复制过程中，染色体末端有一端遗传信息得不到复制，所以在普通人体细胞中，端粒的末端会随周期性复制而逐渐缩短，这就限制了细胞的增殖能力，当至某一特定界限时，细胞将停止分裂而凋亡。端粒不仅被认为是与细胞衰老有关，而且还与许多疾病有关。所以端粒的研究在癌症治疗领域意义重大。

目前已存在了一些研究端粒的常用方法：DNA印迹法、杂交保护分析法(HPA)、定量PCR法(PCR)、单个端粒长度分析法(STELA)，但这些方法都存在着各种问题，例如不能在细胞水平给出详细的端粒信息，不均匀的引物退火可能导致端粒长度测量不充分以及引物自身之间可能发生杂交等问题。而荧光原位杂交技术(FISH)利用端粒特异性，直接将探针标记在端粒序列上，结合荧光显微镜技术，不仅操作简单，而且尺寸小的端粒探针增加了进入细胞的渗入度。通常，FISH技术使用的荧光显微技术，其成像分辨率受光学衍射极限限制，一般只能达到200-300nm。这一分辨率使得人们无法对端粒进行细致地观察。

光学超分辨成像突破了衍射极限限制，达到更高的空间分辨率。现在用于超分辨成像的技术主要包括3类：基于光调制的受激发射损耗(STED)技术和结构光照明显微镜(SIM)技术以及基于单分子定位的光激活定位显微镜(SMLM)和随机光学重构显微镜(STORM)。相比于STED和SIM技术，单分子定位显微镜(SMLM)的成像分辨率更高，这使得单分子定位技术在生物医学领域得到广泛运用。因此，利用单分子定位技术进行端粒成像，有望对端粒的结构进行深入地研究。

发明内容

发明目的：本发明为了克服端粒检测中遇到的检测步骤复杂且检测不准确的问题，提供了这一种端粒探针，实现端粒的精准检测。本发明还提供了该端粒探针的制备方法及其应用。

技术方案：本发明所述一种端粒探针，为在CdSSe/ZnS量子点表面偶联了单链DNA；所述单链DNA通过5’端的氨基与CdSSe/ZnS量子点表面的羧基配体偶联；所述单链DNA序列为3’-AATCCCAATCCCAATCCCTTTTT-(NH₂)₆-5’。

上述的端粒探针的制备方法，包含以下步骤：

(1)油相量子点转相：将油相CdSSe/ZnS量子点溶于三氯甲烷中，加入巯基丙酸，混合均匀后再加入四甲基氢氧化铵调节溶液pH值，搅拌反应；反应结束后，向溶液中加入水，搅拌，静置分层，取上清液；在上清液中加入无水乙醇沉淀，离心，去除上清液，所得沉淀为水相CdSSe/ZnS量子点；将油相CdSSe/ZnS量子点转化为水相CdSSe/ZnS量子点，原因是使CdSSe/ZnS量子点符合单分子定位技术对荧光探针的要求，即量子点在水溶液或者磷酸盐缓冲液中具有单波长激发下的荧光闪烁行为。