[发明专利]一种泛生菌酰胺酶突变体、基因、工程菌及其应用

权利要求书

1.一种泛生菌酰胺酶突变体，其特征在于所述酰胺酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列进行以下的点突变：(1)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸；(2)第301位的苏氨酸突变为亮氨酸；(3)第305位的丙氨酸突变为苏氨酸；(4)第309位的丝氨酸突变为酪氨酸；(5)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸的同时将第301位的苏氨酸突变为亮氨酸；(6)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸的同时将第305位的丙氨酸突变为苏氨酸；(7)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸的同时将第309位的丝氨酸突变为酪氨酸；(8)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸并且第301位的苏氨酸突变为亮氨酸的同时将第305位的丙氨酸突变为苏氨酸；(9)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸并且第305位的丙氨酸突变为苏氨酸的同时将第309位的丝氨酸突变为酪氨酸。

2.一种权利要求1所述泛生菌酰胺酶突变体编码基因。

3.一种权利要求2所述泛生菌酰胺酶突变体编码基因构建的重组基因工程菌。

4.一种权利要求1所述泛生菌酰胺酶突变体在催化2-氯烟酰胺制备2-氯烟酸中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的应用是以含泛生菌酰胺酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以2-氯烟酰胺为底物，以pH为7.5～8.5的缓冲液为反应介质构成反应体系，在30～60℃、150～500r/min条件下进行转化反应，反应结束后取反应液分离纯化，获得2-氯烟酸。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述反应体系中，底物的初始浓度为50～300mM，所述催化剂的用量以湿菌体重量计为1～10g/L反应体系。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述底物以补料形式加入，当反应体系中底物残留浓度低于加入量20％时，补加终浓度50～200mM的底物。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含泛生菌酰胺酶突变体编码基因的工程菌接种到含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150r/min培养12h，随后以体积浓度1％接种量转接到新鲜的含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150r/min培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.4～0.8，再向培养基中加入终浓度为0.1～1mM的IPTG，28℃、150r/min诱导培养12h，取培养物离心，收集沉淀即获得湿菌体；所述LB液体培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH值为7.0。