[发明专利]一株硫酸盐还原菌，分离鉴定方法及其应用

说明书

本发明提供一种硫酸盐还原菌（Sulfate‑Reducing Bacteria），即梭菌LYS08，Clostridium sp.LYS08，于2017年9月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为，CCTCC NO：M 2017562，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。同时提供了硫酸盐还原菌的分离鉴定方法，具体对沼液进行的第三代富集培养液稀释的菌悬液加到冷却至40‑50℃的琼脂培养基，凝固后放入厌氧罐中置于45℃下培养，至菌落长出；将长出的黑色单菌落接种至SRB选择培养基中进行增殖培养，再进行分离，增殖培养，如此重复3次固液交替的分离过程后，即可分离分离得到硫酸盐还原菌LYS08。本发明将所述的硫酸盐还原菌在降解SO₄^2‑上的应用。

技术领域

本发明提供一种硫酸盐还原菌，并提供了该硫酸盐还原菌的分离及鉴定方法。

背景技术

硫酸盐还原菌(Sulfate-Reducing Bacteria，简称SRB)是一类能把硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等氧化态硫化物还原为H₂S的微生物，广泛存在于各种自然或生产条件下的缺氧环境中(如厌氧泥浆、淡水沉积物、油田管道系统、人或动物的口腔和胃肠道内)，在硫元素的地球生物循环及环境保护中发挥着极其重要的作用。SRB因其在不同的生物化学反应过程中扮演着不同角色而成为人们关注和研究的热点，如在沼气发酵系统中SRB和产甲烷菌会存在对乙酸、氢和较高级脂肪酸等基质的竞争而影响甲烷产量，研究利用SRB处理含高浓度硫酸盐的有机废水，探索如何控制SRB造成微生物腐蚀及腐蚀机理。此外，李军等利用富集培养的硫酸盐还原菌污泥对木屑进行生物降解处理，发现木屑中的木质素和纤维素能被有效降解。由此可见，SRB具有重要的科研和实际应用价值。

发明内容

本发明利用硫酸盐还原菌选择性培养基和浇注倒平板的方法从一组能高温发酵蔬菜废叶产甲烷的菌群中分离获得一株细菌，对其16S rRNA基因进行全序列测序比对分析，结果显示该菌与GenBank中一株厌氧细菌的相似性最高(为95％)，但序列Blast比对结果中没有SRB类细菌。对分离获得的菌株进行定性检测，结果表明该菌能使含有亚铁盐的液体培养液变黑且在瓶口处可闻到臭鸡蛋味。因此，综合上述信息初步判断分离获得的菌株为一株新发现的SRB，并对其生理与形态特征以及生长性质进行了研究。

硫酸盐还原菌(Sulfate-Reducing Bacteria)，及梭菌LYS08，Clostridiumsp.LYS08，于2017年9月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为，CCTCC NO：M2017562，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

本发明所提供的硫酸盐还原菌的分离鉴定方法，包括如下步骤：

(1)用SRB富集培养基对沼液进行三代富集培养；

(2)对第三代富集培养液稀释至10^-3、10^-4、10^-5的菌悬液；取各稀释度菌悬液分别加到已冷却至40-50℃的琼脂培养基，每个稀释度倒3块平板，待琼脂培养基凝固后放入厌氧罐中置于45℃下培养至长出菌落；

(3)挖取平板中长出的黑色单菌落，接种至SRB选择培养基中进行增殖培养，再对菌液进行上述的浇注倒平板分离，然后再挖取单菌落转液体培养基增殖，如此重复3次固液交替的分离过程后，即可分离得到硫酸盐还原菌LYS08，即梭菌LYS08，Clostridiumsp.LYS08；

(4)将分离获得的LYS08菌株接种至SRB鉴定培养基中培养，4-6h后培养液完全变黑，15-22h后培养瓶底部出现黑色沉淀，由此判断LYS08菌株属硫酸盐还原菌。

所述的步骤(1)中，所述的沼液为蔬菜废液沼气发酵罐的沼液。