[发明专利]一种外泌体微量DNA的建库方法

说明书

一种外泌体微量DNA的建库方法，包括：将包含转座子末端序列和标签序列的DNA序列与TN5酶包埋成TN5酶复合物；将外泌体、所述TN5酶复合物和含有IGEPAL的反应缓冲液共同孵育，使所述外泌体裂解并使外泌体DNA片段化；对片段化的外泌体DNA进行纯化，然后对纯化的外泌体DNA进行扩增，得到外泌体DNA文库。本发明实现外泌体微量DNA的TN5高通量文库构建，解决现有外泌体DNA建库技术的操作复杂、周期长、通量低等问题，为基于外泌体DNA分子诊断与应用奠定技术基础。

技术领域

本发明涉及外泌体检测技术领域，具体涉及一种外泌体微量DNA的建库方法。

背景技术

研究发现，外泌体(exosome)是一类40-150nm大小、含有许多可分析的DNA、mRNA、microRNA、lncRNA、circRNA等核酸物质以及蛋白分子和脂质分子的生物活性双脂膜囊泡体。研究发现从血液、尿液、唾液、泪液、乳液、淋巴液等体液中均可分离获得高纯度外泌体，并且体外分离的外泌体较为稳定且核酸片段覆盖所有染色体信息，是细胞间、亚细胞间信号通讯、细胞存活、凋亡、细胞稳态平衡的重要介质。目前研究者们已能够通过生物分子技术手段筛选出前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌等多种肿瘤的外泌体mRNA、microRNA等生物标志物并且能够一定程度上反映疾病发展进程；自2014年发现外泌体DNA的存在后，利用双脱氧法(sanger)测序、液滴聚合酶链反应(Droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR)等方法，已发现肿瘤患者来源的外泌体中存在细胞核及线粒体DNA分子片段含有肿瘤基因突变信息，并且具有较高的检出率和灵敏度，可作为肿瘤等疾病的早期筛查和发展进程的生物分子标记。然而，目前外泌体检测技术包括sanger测序、ddPCR检测覆盖度低，通量低；而二代高通量测序建库方式，包括DNA片段化、加接头、修复、片段选择等操作，操作过程复杂，耗时较长，所需要的DNA起始量较高，亦不适合微量外泌体DNA的建库。因此，开发一种适于外泌体微量DNA的建库技术进一步解析外泌体DNA与疾病的关联分析十分重要。

研究发现，TN5转座酶能够随机介导双链DNA的片段化并短时间内添加寡核苷酸片段，这使得TN5酶能够应用于二代测序的文库制备中。但是目前针对外泌体DNA文库的构建，尚无TN5酶的应用案例。

发明内容

针对外泌体微量DNA建库技术的空白与不足，本发明首次实现了外泌体微量DNA的TN5高通量文库构建，解决了现有外泌体DNA建库技术的操作复杂、周期长、通量低等问题，为基于外泌体DNA分子诊断与应用奠定技术基础。

因此，本发明提供一种外泌体微量DNA的建库方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)TN5酶复合物制备：将包含转座子末端序列和标签序列的DNA序列与TN5酶包埋成TN5酶复合物；

(2)外泌体裂解及转座：将外泌体、上述TN5酶复合物和含有IGEPAL的反应缓冲液共同孵育，使外泌体裂解并使外泌体DNA片段化；

(3)片段纯化及扩增：对片段化的外泌体DNA进行纯化，然后对纯化的外泌体DNA进行扩增，得到外泌体DNA文库。

需要说明的是，经过片段纯化及扩增以后得到的外泌体DNA文库，不局限于特定测序平台的测序文库，这种外泌体DNA文库可以根据各测序平台的要求制成相应的测序文库，例如通过在两端添加接头形成带接头的双链线性测序文库；或者通过变性得到单链然后环化得到环状DNA文库。

因此，作为一个优选的技术方案，本发明的方法还包括：

(4)文库环化及酶切：将扩增产物变性并环化以形成环化单链DNA，然后酶切去除未环化的DNA，得到外泌体DNA测序文库。

优选地，上述方法还包括：提取样本中的外泌体。

优选地，通过梯度离心从样本中除去大的沉淀物，上清经微孔滤器过滤和超速离心得到微量外泌体。