[发明专利]一种有效观察番茄根结巨型细胞石蜡切片方法

说明书

本发明公开了一种有效观察番茄根结巨型细胞石蜡切片方法，本方法对影响番茄根结巨型细胞石蜡切片效果的三个关键因素进行了研究，建立了包括新的取材，包埋方式以及挑片技术的番茄根结巨型细胞石蜡切片技术。本发明的技术，明显提高了番茄根结石蜡切片的工作效率，提高了挑片质量，保证了番茄根结巨型细胞石蜡切片的效果。该方法实操性强，技术参数明确，可用于开发相关的石蜡切片包埋模具及配套使用的石蜡切片专用技术，进行广泛推广应用。

技术领域

本发明涉及显微观察植物样品技术领域，尤其涉及一种植物组织石蜡切片方法，具体涉及一种有效观察番茄根结巨型细胞石蜡切片方法。

背景技术

根结线虫(Meloidogyne spp.)是世界范围内危害巨大的土传病虫害之一，可侵染2000多种植物，给全世界的果树、蔬菜和粮食生产带来巨大的损失，是最普遍和重要的农作物线虫病害(冯志新，2001)。根结线虫为植物根部内寄生线虫，生活在土壤表层的5-30cm范围内。一般情况下在平均温度28℃时，作物生长季中完成整个生活史需要25天，一个生长季节可以繁殖3-4代，每一代的繁殖量较大，平均每条雌虫可产生300-500个卵(刘维志，2000)。根结线虫的二龄幼虫侵染植物根部后，进入根的皮层并在细胞间隙中移至根尖伸长区的维管组织找到合适的定居点，诱导植物维管组织细胞重新分化成巨型细胞并产生瘤状的根结。根结线虫固着寄生在植物体内，从巨型细胞内吸收水分和营养，生长发育为成虫，直到完成整个生活史(Bird,1996)。根结的形成阻断了植株对水分和养分的正常运输与吸收，导致植株生长发育不良(文廷刚等，2008)，引起作物减产。因此，控制根结线虫的种群数量十分重要。

目前对作物根结线虫病的防治较为困难。随着分子生物学技术的日趋成熟，通过分子生物学技术深入研究根结线虫与其寄主植物巨型细胞的分子互作机理，培育新型的转基因抗线虫作物，从根本上切断根结线虫的侵染途径，从而对根结线虫进行防治是当前努力的目标，因此揭示植物根结巨型细胞的发育过程至关重要。

巨型细胞的发育过程常常需要用到石蜡切片技术。石蜡切片是植物学研究中常用的一种实验技术，为植物组织细微结构的观察作出重大贡献。石蜡切片是常规切片技术中应用最为广泛的技术之一，制成的玻片标本能够长期保存是其最大的优点，在组织学和病理学中得到了广泛应用(王秀文，2015)。一张质量优良的切片必须具备完整、组织面平整、厚薄适当、染色清晰和反差强的特点(廖秋萍等，2006)。石蜡切片法沿用多年，已经形成较为成熟的操作步骤，但在制作石蜡切片时，也会遇到脱片、切片碎裂、蜡带不连续、切片褶皱、染色效果不佳、模糊不清及细胞结构染色对比不明显等现象，极其影响后期观察。石蜡切片中每一环节都具相关性，环环相扣，制作出优质切片，每一步都至关重要，任何一个环节操作不规范都有可能影响最终的切片质量。影响片子质量的的因素有很多，不仅受组织本身特性的影响，还受标本的取材、组织块固定、脱水、包埋、浸蜡、切片、染色等因素的影响(Wang et al.,2014)，因此需要针对每种材料的特点，建立适合的石蜡切片技术。

目前番茄基因组测序工作已经完成(Tomato Genome Consortium,2012)，番茄是一种理想的根结线虫寄主植物，建立易操作、质量高的番茄根结巨型细胞石蜡切片是一个需要解决的问题。目前仅袁林(2007)发表了番茄根结巨型细胞石蜡切片技术的研究结果，但是存在切片中番茄根结根结线虫变形和早期巨型细胞内含物缺失的现象；王磊(2011)仅发表了关于一个番茄根结巨型细胞摘要，未见图片效果，也未见后续论文发表。以前虽有其它植物根结组织石蜡切片的报道，但是，不同种类的植物组织有不同的特性，相关结果虽然有借鉴意义，却不能完全应用于番茄根结巨型细胞组织切片研究。所以发明了针对番茄根结巨型细胞石蜡切片的部分关键技术，并用于石蜡切片中。

发明内容

本发明的目的在于提出一种有效观察番茄根结巨型细胞石蜡切片方法，该方法建立了包括取材、包埋方式以及挑片新技术，得到了符合要求的番茄根结巨型细胞石蜡切片。

本发明所采用的技术方案：一种有效观察番茄根结巨型细胞石蜡切片方法，包括如下步骤：