[发明专利]靶向血红蛋白HBB突变基因的造血干细胞基因修饰方法

说明书

本发明公开了一种靶向血红蛋白HBB突变基因的造血干细胞基因修饰方法，方法一：gRNA1、gRNA2和spCas9‑2.0的mRNA电转进入含血红蛋白HBB突变基因的CD34+细胞；细胞培养1天后，以rAAV‑HBB转染CD34+细胞，收获细胞；方法二：Cas9蛋白与gRNA1、gRNA2混合重组，电转进入CD34+细胞；细胞培养1天后，以rAAV‑HBB转染CD34+细胞，收获细胞。本发明以中国广东广西最常见的HBB突变中CD41/42(‑CTTT)为靶，基因编辑完成后，不在染色体上留下任何其他突变或插入序列，基因编辑效率可达15％～20％。

技术领域

本发明涉及靶向血红蛋白HBB突变基因的造血干细胞基因修饰方法，属于新型的基因编辑纠正遗传突变领域。

背景技术

地中海贫血(Thalassemia)于1925年由Cooley和Lee首先描述了这种发生在意大利儿童的严重贫血，由于最早发现于地中海区域，故称为地中海贫血或海洋性贫血(简称地贫)，据全国医学名词审定委员会规定应称为“珠蛋白生成障碍贫血”。地中海贫血是由于一种或多种珠蛋白肽链合成受阻或完全抑制，使血液中血红蛋白成分组成异常，导致的一种慢性遗传性溶血性贫血。地中海贫血是一种常见的常染色体隐性遗传病，是世界上最常见和发病率最高的遗传性溶血性贫血，也是危害最严重的血红蛋白病之一。其中研究比较透彻的一种是镰刀型细胞贫血病，病人的大部分红细胞呈镰刀状，其特点是病人的血红蛋白β—亚基N端的第六个氨基酸残基是缬氨酸(val)，而不是正常的谷氨酸残基(Glu)。但在中国广东广西最常见的是HBB突变中CD41/42(-CTTT)。

据WHO估计，每年出生的各类重型地中海贫血患儿数至少有20万。目前尚无治疗地中海贫血的有效方法，而且医疗费用昂贵，患者和家庭承受着巨大的经济压力和精神痛苦。

20世纪80年代曾溢滔院士主持开展了我国20省市自治区近60万人口的地中海贫血病的调查工作。根据12省地中海贫血的流调结果，该病主要分布在我围长江沿岸及以南的地区，包括11个省区以及陕西、甘肃、新疆等地。按当时的调查结果，该病的检出率为3.62％，其中α和β地中海贫血的检出率分别为2.95％及0.67％。近30年来未再开展全国范围内地中海贫血症的调查工作，只有广东、广西、云南等省开展区域性的调查工作。我国南方地区各地报道的地中海贫血基因缺陷率为2.5％～20％，而广东及广西两省地中海贫血基因缺陷发生率分别高达10％及20％，两省地中海贫血的病例占全国总数的2/5以上。

目前国内外对地中海贫血治疗分类(1)主要方法：规范性长期输血和去铁治疗；(2)根治方法：HLA相合的造血干细胞移植；(3)姑息方法：脾切除术或脾动脉栓塞术等。轻型地中海贫血一般不需治疗。

近年来，由于基因工程技术的突飞猛进，CRISPR/Cas技术俨然已经成为科学界的热点之一，被广泛应用于各类体内和体外的遗传学改造、构建转基因模式动物，以及基因治疗等领域。2013年Science上连载了两篇具有重要意义的CRISPR技术论文，麻省理工学院Zhang Feng的研究组，II型原核CRISPR适应性免疫系统已显示促进RNA指导的位点特异性DNA切割。研究人员设计两个不同的II型CRISPR系统，并证明Cas9核酸酶可以通过短RNAs诱导精确切割在人类和小鼠细胞内源基因组基因位点。Cas9也可以转化为切口酶促进具有最小诱变活性的同源定向修复。最后，可以将多个引导序列编码到单个CRISPR阵列中，以使得能够同时编辑哺乳动物基因组内的多个位点，展示CRISPR技术的容易操作的可编程性和广泛的适用性。Church的研究组首次使用CRISPR技术完成了RNA介导的人类基因组编辑。他们使用基因工程方法修改细菌的II类CRISPR系统，并比较了这种新系统与传统TALEN方法在基因组编辑方面的效率差异，结果发现这种方式比TALEN有更快的时效性。仅这一年内，CRISPR/Cas领域就取得了如此多鼓舞人心的突破，为其在基因治疗等多领域发展奠定基础。