[发明专利]一种土牛膝离体组培快繁方法

权利要求书

1.一种土牛膝离体组培快繁方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）无菌苗的获得：选取饱满的土牛膝种子,用75%酒精消毒65s，再用0.1%升汞溶液消毒15min，最后用无菌水漂洗4次，用无菌滤纸吸干表面水分后接种到种子萌发培养基中，接种后每天光照21小时，光照强度为2500lx，培养温度为22℃，空气相对湿度为75%的条件下培养20天后统计萌发率，萌发培养基为：1/2MS+0.06mg/LNAA+29g/L蔗糖+6.8g/L琼脂，pH为5.9；

（2）愈伤诱导：当无菌苗的子叶刚展开时,取无菌苗的茎尖作为外植体,用解剖刀切成0.6cm左右长度,接种于用于愈伤诱导的培养基中培养，接种后每天光照11小时，光照强度为2500lx，培养温度为22℃，空气相对湿度为75%的条件下培养26天后统计诱导率，愈伤诱导培养基为：MS+6.0mg/L6-BA+0.6mg/LNAA+0.8mg/L KT+28g/L蔗糖+5.8g/L琼脂，pH为5.9；

（3）增殖培养：将步骤（2）诱导得到的愈伤组织切割成0.6cm³大小的小块并转入增殖培养基进行扩繁，接种后每天光照11小时，光照强度为3200lx，培养温度为22℃，空气相对湿度为75%的条件下培养26天后统计增殖情况，增殖培养基为：MS+2.0mg/L6-BA+0.6mg/L NAA+26g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH为5.9；

（4）分化培养：将步骤（3）增殖得到的愈伤组织切割成0.6cm³大小的小块并转入分化培养基诱导不定芽的产生，接种后每天光照11小时，光照强度为3200lx，培养温度为22℃，空气相对湿度为75%的条件下培养26天后统计分化情况，分化培养基为：MS+1.2mg/LKT+2.2mg/LNAA+26g/L蔗糖+5.08g/L琼脂，pH为5.9；

（5）生根培养：将步骤（4）分化得到不定芽从基部切下并接种至生根培养基中进行诱导生根，接种后每天光照11小时，光照强度为3200lx，培养温度为22℃，空气相对湿度为75%的条件下培养26天后统计生根情况，生根培养基为：1/2MS+1.2mg/LIBA+0.8mg/L NAA+1.25%活性炭+26g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH为5.8；

（6）炼苗移栽：生根28天后,打开其瓶口,并灌入无菌水,以保证其水分供应，6天后取出生根苗洗净根上所带培养基,移栽到由泥炭土:珍珠岩:蛭石＝2:2:1组成的基质中，用留有透气孔的薄膜覆盖,放置在阴凉透气的室内,16天将薄膜揭去,然后室外培养,隔天浇一次水,移栽26天后统计成活率。