[发明专利]一种重组高温镍铁氢化酶的异源表达纯化方法及其应用

说明书

本发明公开一种重组高温镍铁氢化酶的异源表达纯化方法及其应用，属于镍铁氢化酶的表达纯化及应用领域。本发明所公开的高温镍铁氢化酶来源于极端嗜热厌氧古菌Pyrococcus furiosus，利用穿梭载体在另一极端嗜热厌氧古菌Thermococcus kodakarensis进行重组过表达，通过组氨酸标签与镍柱的特异性结合，简化重组氢化酶的纯化过程，提高氢化酶的产量；并通过与一种含黄素单核甘酸(FMN)的黄递酶(diaphorase,DI)相偶联，形成一条新的电子传递途径，利用氢气实现辅酶NADH的再生。本发明建立的重组高温镍铁氢化酶的表达纯化方法，具有步骤简单，酶产量高，生产成本低等特点；此外，本发明建立的辅酶再生体系，以氢气(气体)为底物，对反应体系的影响小，不会改变溶液的酸碱值，而且产物容易分离。

技术领域

本发明涉及一种重组高温镍铁氢化酶的异源表达纯化方法及其辅酶再生应用，属于镍铁氢化酶的表达纯化及辅酶再生领域。

背景技术

氢化酶催化可逆的质子还原产氢反应，是生物制氢、氢能源电池等相关基础研究中的关键酶。氢化酶按其活性中心所含的金属离子不同，可分为单铁氢化酶(Fe Hase)，双铁氢化酶(FeFe Hase)，镍铁氢化酶(NiFe Hase)。Fe Hase只在一部分甲烷古细菌中被发现，FeFe氢化酶的催化产氢活性比较高，但对氧高度敏感；相对而言，NiFe氢化酶分布广泛，对氧的敏感度略低，遇氧失活是可逆的，而且高温NiFe氢化酶具有更好的热稳定性，有更好的工业应用前景。

来源于极端嗜热古菌Pyrococcus furiosus(最适生长温度为100℃)的可溶性氢化酶I(SHI)是一种双向镍铁氢化酶，热稳定性好，在90℃时半衰期是14小时，在40℃时的半衰期长达208小时。SHI在20到100℃的温度范围内均有活性。SHI是异四聚体蛋白复合体，分别包括NiFe活性中心(α)，两个铁硫簇(β)，一个黄酮腺嘌呤二核苷(FAD)和一个铁硫簇(γ)，以及三个铁硫簇(γ)，由一个独立的基因操纵子编码(PF0891-PF0894)。NiFe-氢化酶的异源表达非常困难，因为NiFe活性中心的成熟过程十分复杂，是一种精确协调的蛋白翻译后修饰过程，需要一系列的辅助蛋白(HypABCDEF以及特殊的肽链内切酶)。目前关于SHI的异源表达只在大肠杆菌中进行过实验研究，但是产量极低，远低于P.furiosus同源过表达纯化的结果。

Thermococcus kodakarensis是自地热温泉中分离的一种严格厌氧生长的极端嗜热古菌，其最适生长温度为85℃，它与P.furiosus均属于热球菌目，但后者的最适生长温度高达100℃。T.kodakarensis能在含有多肽、淀粉、丙酮酸或几丁质等的培养基上繁殖生长，以单质硫或质子作为最终电子受体，分别生成H₂S或H₂。2005年，T.kodakarensis的全基因组测序就已完成，天然感受态细胞特性以及穿梭载体的运用，使得T.kodakarensis的遗传操作体系日趋成熟，已成功利用同源重组进行基因敲除、基因插入，或利用穿梭载体在T.kodakarensis中表达功能基因。此外，在T.kodakarensis中发现与SHI蛋白序列一致性高达83.7％的可溶性氢化酶，因此，推测T.kodakarensis中的氢化酶辅助蛋白以及特异的肽链内切酶可能适用于SHI的成熟过程。

由于大多数极端嗜热古菌的遗传改造很难进行，限制了高温表达平台的发展，因此，T.kodakarensis的基因改造操作系统，使T.kodakarensis逐渐发展成为研究高温厌氧酶的表达及筛选平台。

此外，氧化还原酶在温和的液体环境下具有较高的立体选择性，因此被广泛应用于手性化合物的生物合成。然而，氧化还原酶催化的生物氢化反应需要还原性的辅酶，NADH或NADPH作为氢供体，因此，辅酶的有效再生对于工业的经济可行性至关重要。辅酶再生的方法很多，但是利用氢化酶的辅酶再生方法有其独特的优势：气态底物氢气不会影响液体反应体系，而且产物容易分离。SHI应用于NADPH的再生已经早有报道，但由于其对于NAD的亲合性远低于NADP，尚未有研究将其用于NADH的再生。

发明内容