[发明专利]一种丛枝菌根真菌的保藏方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域方面，具体涉及一种丛枝菌根真菌的保藏方法。

背景技术

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是一类能与地球上80％的植物根系形成共生体的菌根真菌，对植物的生长发育具有重要作用。菌种保藏是微生物学及相关学科研究的基础，其目的是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于未来持久的研究和应用，故菌种保藏也是AMF研究中的一项重要的内容。然而由于AMF特殊的生物特性―不能纯培养，只能与植物根系共生后才能完成生活史。因此，世界各国的AMF的资源收集与保藏机构都是和普通微生物菌种库分开，而独立建成的。目前AMF保藏方法主要有寄主传代保藏法、低温保藏法和超低温保藏法。

寄主传代保藏法包括盆栽传代保藏法和离体根器官传代保藏法，盆栽传代保藏法能始终长久保持AMF菌种的高生活力和新鲜度，但该法比较费时、费力、需要较大的空间和温室条件，并且还存在杂菌污染的风险；离体根器官传代保藏法主要是利用双重培养技术对AMF 进行传代保藏，该法保藏的菌剂纯度较高，但对保藏条件和操作者的技术要求较高，故不能被多数人使用。低温保藏法是将AMF菌剂放置在4℃冰箱中保藏，这种方法会占用大量空间，菌种活力下降较快，保藏效果不佳。超低温保藏法是将AMF繁殖体与冷冻保护剂结合，放置在液氮或-80℃冰箱中保藏，这种方法使菌剂保藏时间较长，但需要专门的设备，操作步骤繁琐，成本较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种丛枝菌根真菌的保藏方法，以解决现有技术费时、费力、需要较大的空间和温室条件或操作步骤繁琐，成本较高等问题。

本发明采用如下技术方案：一种丛枝菌根真菌的保藏方法，包括以下步骤：

(1)采用湿筛倾析法和蔗糖离心法从盆栽扩繁菌剂中分离得到丛枝菌根真菌孢子，消毒后制得丛枝菌根真菌孢子悬浮液；

(2)以海藻酸钠、明胶、卡拉胶和聚乙烯醇作为载体，灭菌后，将上述孢子悬浮液包埋到载体中得到菌剂混合物；

(3)将所述菌剂混合物通过物理挤压方式滴入无菌交联剂中制成球状物，固化清洗后得到丛枝菌根真菌包埋小珠；

(4)将丛枝菌根真菌包埋小珠置于干燥箱中干燥；

(5)将干燥后的丛枝菌根真菌包埋小珠转移至10mL离心管中，放置于4℃冰箱中长期保藏。

在步骤(1)中，丛枝菌根真菌孢子悬浮液通过以下步骤制备：

A、以三叶草、万寿菊、玉米3种植物为寄主，将丛枝菌根真菌进行盆栽培养，3个月后收获地下部分，置于阴凉处自然风干，得到丛枝菌根真菌扩繁菌剂；

B、采用湿筛倾析法和蔗糖离心法从盆栽扩繁菌剂中分离得到丛枝菌根真菌孢子；

C、将丛枝菌根真菌孢子消毒15min，用无菌水漂洗6～10次得到丛枝菌根真菌孢子悬浮液。

优选地，在步骤(2)中，所述载体为海藻酸钠载体、明胶和海藻酸钠混合载体、卡拉胶和海藻酸钠混合载体、聚乙烯醇和海藻酸钠混合载体；海藻酸钠、明胶、卡拉胶和聚乙烯醇的质量浓度分别为1～2％、3～5％、2～3％和8～10％；所述灭菌操作是将载体在121℃，0.12MPa 压力下蒸汽灭菌20min。

优选地，在步骤(3)中，所述物理挤压方式为将所述菌剂混合物用移液枪挤压；包埋载体所用交联剂为氯化钙溶液；所用交联剂质量浓度为2～4％，进一步优选为3％；包埋小珠的固化时间为2～4h。

优选地，在步骤(4)中，所述丛枝菌根真菌干燥温度为27℃，干燥时间为48h。

优选地，所述的丛枝菌根真菌为摩西球囊霉。

为了既能保持丛枝菌根真菌菌种原有的特性，同时也希望保藏方法简单易行，本发明提供一种丛枝菌根真菌的保藏方法，以海藻酸钠、明胶、卡拉胶和聚乙烯醇作为载体，将丛枝菌根真菌孢子悬浮液包埋到载体中得到菌剂混合物，将菌剂混合物通过物理挤压方式滴入交联剂中制成球状物，固化清洗后得到丛枝菌根真菌包埋小珠，干燥后，放置于4℃冰箱进行保藏。

本发明提供的丛枝菌根真菌保藏方法，操作简单，成本低廉，与普通保藏方法相比，不需要占用大量空间，节省物力和人力。同时，本发明能够有效保存丛枝菌根真菌活性，丛枝菌根真菌包埋小珠可直接作为菌剂接种于寄主植物。

附图说明

图1为不同菌剂对番茄幼苗生长发育的影响；

图2为不同菌剂对番茄光合特性的影响；

图3为不同菌剂对番茄根系菌根侵染率的影响；

图4为不同菌剂对黄瓜根系菌根侵染率的影响。