[发明专利]PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗及制备方法

权利要求书

1.一种PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗，其特征在于，所述PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗以昆虫作为宿主细胞，转染包含PCV2重组杆状病毒ORF2基因片段的真核表达载体。

2.根据权利要求1所述的一种PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗，其特征在于，所述PCV2重组杆状病毒ORF2基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的一种PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗，其特征在于，所述真核表达载体为pAcGP67-A-PCV2，是将PCV2重组杆状病毒ORF2基因片段克隆到pAcGP67-A载体中的EcoR1/BglII双酶切位点而得到的；所述昆虫为昆虫中的Sf9细胞系。

4.一种真核表达载体，其特征在于，该真核表达载体为pAcGP67-A-PCV2，是将PCV2重组杆状病毒ORF2基因片段克隆到pAcGP67-A载体中的EcoR1/BglII双酶切位点而得到的。

5.一种PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法利用分子生物学手段构建含有高免疫原性PCV2ORF2核苷酸序列的重组杆状病毒，所述重组病毒能够在Sf9细胞系中高效表达PCV2衣壳蛋白，并在胞质内组装成具有PCV2表面抗原的PCV2病毒样颗粒，具体包括如下步骤：

(1)采用BD BaculoGold杆状病毒表达系统，将PCV2重组杆状病毒ORF2核苷酸序列通过EcoR1/BglII双酶切连接到pAcGP67-A穿梭载体内，BD BaculoGold^TM线性杆状病毒DNA与pAcGP67-A穿梭载体共转染Sf9细胞获得重组杆状病毒，筛选高滴度重组杆状病毒作为生产用毒种；

(2)采用细胞生物反应器对Sf9细胞进行全悬浮无血清培养，当细胞密度培养至1.5-2×10⁶cells/ml，利用步骤(1)中筛选的高滴度重组杆状病毒进行感染，全悬浮无血清培养5-7天，收获病毒，蛋白生产量可达200～300mg/l，表达蛋白可形成病毒样颗粒；

(3)对收获的病毒原液进行过滤系统处理和灭活，辅之以佐剂，制成免疫性高、安全性好的PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗。

6.根据权利要求5所述的一种PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中PCV2ORF2核苷酸序列为GenBankAIT11738.1序列，是PCV2重组杆状病毒ORF2核苷酸序列的质粒pUC57-PCV2根据穿梭载体pAcGP67-A多克隆位点序列，分别在ORF2序列5’端和3’端加入EcoR1和BglII酶切位点；所述PCV2重组杆状病毒ORF2核苷酸全长713bp，具体序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求5所述的一种PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中无血清培养基为EX-CELL^TM 420无血清培养基；Sf9细胞在细胞生物反应器中的培养条件为：细胞接种量为2-5×10⁵cells/ml，细胞生物反应器转速为80-90rpm，培养温度为26-28℃，溶氧值60％-80％，pH值为6.2-6.5；高滴度重组杆状病毒接种量MOI为1-10，培养温度为26-28℃，pH值为6.2-6.5。

8.根据权利要求5或7所述的一种PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中表达蛋白为重组杆状病毒表达的PCV2衣壳蛋白，具体氨基酸序列如Seq ID No.2所示。

9.根据权利要求5所述的一种PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗采用的灭活剂为二乙烯亚胺；灭活步骤为5mM二乙烯亚胺在37℃灭活72小时。

10.根据权利要求5或9所述的一种PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗抗原佐剂选用5984EP聚合物，终浓度为01.～0.5mg/ml。