[发明专利]还原性糖链和糖蛋白O-糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化及分离分析方法

说明书

技术领域

本发明属于糖生物学技术领域，具体涉及还原性糖链和糖蛋白O-糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化及分离分析方法。

背景技术

糖类物质作为构建生命体的第三类生物大分子，具有十分重要生物学功能，如为生物体提供能量物质，是构成植物细胞壁的主要组成部分，在细胞的分化、发育、肿瘤的发生与细胞间的信号转导、识别、免疫应答等发挥着重要的作用。糖基化是蛋白质翻译后修饰中最主要的修饰之一，在蛋白质翻译调控、蛋白质降解等过程中起着非常重要的作用。50％以上的蛋白质以糖蛋白的形式存在，并且越来越多的研究表明，糖基化异常可导致人类疾病。在临床治疗过程中，使用的抗体药物均带有糖基化。

目前，大量的研究表明，糖蛋白上的糖链的异常变化和许多疾病有关，因此以研究糖链的结构和功能为主要内容的功能糖组学吸引了生命科学领域广泛的关注，尤其是以糖链作为研究对象来筛选癌症血清标志物的研究，为人类癌症的早期诊断、预后、治疗、反应预测和群体筛查开辟了新的途径，例如，糖蛋白的糖链末端常常会发生唾液酸化修饰，它不仅可稳定糖链结构，而且与许多恶性疾病的发生发展密切相关；因此对糖链结构进行分离和结构解析显得十分的重要。

但由于天然存在的糖类物质本身不含有发色基团，用高效液相色谱仪对其进行分离检测遇到困难，而衍生化不仅可以使糖链带上紫外或荧光基团，提高检测灵敏度，又可以降低糖链极性，使糖链在色谱柱上保留，便于糖链分离。衍生化技术通过给糖链C-1端半缩醛结构带上疏水性化学基团，改善糖链结构的疏水性，提高糖类物质的离子化效率，进而可提高糖类物质在MS检测分析中的灵敏度。

目前针对还原性糖链C-1末端醛基的柱前衍生化技术主要有：(1)还原胺化法，例如3-氨基-9-乙基咔唑(简称AEC)衍生化；(2)与吡唑啉酮的碱性缩合反应，如，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(简称PMP)；(3)肼类试剂成腙反应，常用苯肼、吉拉德T试剂等。但是，上述衍生化试剂都只带有一个官能团，在对糖链衍生化之后，衍生产物缺乏游离的活性官能团，无法用于糖链的进一步分析，如糖芯片构建、磁球固定化及荧光标记等。

随着糖组学的发展，为了便于糖链的进一步分析，用于糖链衍生化的双官能团衍生化试剂开发非常重要，这类试剂具有两个活性官能团，其中一个官能团可以用于标记糖链的还原端，另一个官能团可为后续糖芯片构建、磁球固定化及荧光标记等提供反应位点，用于功能性分析。这类试剂报道较少，主要有2，6-二氨基吡啶(简称DAP)和N-氨基乙基-2-氨基苯甲酰胺(简称AEAB)这两种，但是它们均携带两个氨基，易产生竞争作用，与糖链反应时选择性不强，且只能应用于还原性糖链的衍生化，对于糖蛋白上的O-糖链并不适用。

鉴于以上问题，开发新的、衍生化效率更高的利用具有两个不同活性官能团的异二官能团试剂对还原性糖链进行衍生化的方法对于糖组学的研究具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术中对还原性糖链进行衍生化的方法反应条件苛刻，衍生化效率不高，且衍生化试剂仅含一个活性官能团，不能实现糖链的进一步分析等缺陷，本发明一方面提供还原性糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法，通过以下技术方案实现：

还原性糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法，具体为还原性糖链与氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，在酸性条件下发生还原胺化反应，生成具有活性亚甲基的糖链衍生物；或在碱性条件下发生迈克尔加成反应，生成具有伯氨基的糖链衍生物；

所述还原性糖链为游离还原性糖链或糖蛋白上释放的糖链，其中，所述游离还原性糖链为从植物、动物中提取的还原性糖链或合成得到的还原性糖链。

进一步地，本发明所述的还原性糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法，包括以下步骤：

步骤(1A)：将还原性糖链加入3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与质子型溶剂配制得到的溶液中，所述3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮在溶液中的浓度小于1mol/L,所述反应体系中3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与还原性糖链的摩尔浓度之比大于或等于10:1；

步骤(2A)：向反应体系中加入有机弱酸，所述有机弱酸在反应体系中的体积百分比为7％～25％，反应体系的pH大于3且小于6，加热至65℃～75℃，反应1小时～2小时；

步骤(3A)：反应结束后，向步骤(2A)的反应体系中加入氰基硼氢化钠，所述氰基硼氢化钠与还原性糖链的物质的量之比大于或等于20:1；