[发明专利]用于检测白酒发酵过程中耐酸乳酸杆菌含量的两对特异性引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言本发明涉及一种检测Lactobacillus acetotolerans的2对物种特异性引物及其在白酒质量控制中的应用。

背景技术

白酒是我国传统的发酵食品，有着悠久的历史，从古至今一直受到人们的喜欢。中国传统白酒是以富含淀粉质的粮谷类为原料，以中国酒曲为糖化剂，采用固态、半固态或液态发酵，经蒸馏、贮存和勾调而成的含酒精的饮料。

乳酸杆菌是指能够使糖类发酵产生乳酸的细菌，是乳酸菌中最大的一个属.乳酸杆菌属于乳酸杆菌科，在大曲、小曲及其酒醅中均存在.在白酒生产中，乳酸菌在白酒口味及香味上也有很重要的作用。乳酸菌能发酵糖类生成乳酸，在酒醅内通过酯化作用产生乳酸乙酯.乳酸乙酯使白酒具有独特的香味.乳酸杆菌又是窖泥中主要的微生物之一，往往与丁酸菌、己酸菌、甲烷菌、硫酸盐还原菌、硝酸盐还原菌等菌类共存“共生”。有的乳酸菌还同时生成少量的乙酸、乙醇、丙酸、丁酸、丙酮酸等物质，共同调节酒体风味。在酒类发酵过程中由于酒精含量等环境压力使微生物的生长受限，少数种类的细菌在这种条件下保持活力，其含量超过一定限度后会导致发酵质量降低或发酵失败，被认定为酒类腐败微生物。作为重要的酒类腐败菌Lactobacillus acetotolerans被证实是一种培养较困难，且经常出现在中国南方酿酒厂中的一种微生物.另外，Lactobacillus acetotolerans具有产生乳酸的能力；影响酒类口感的关键之一是乙酸和乙酰作为碳水化合物发酵的终产物。白酒生产需要适量的乳酸，否则，无乳酸与乳酸乙酯，白酒风味极差。但乳酸过多将使酒醅酸败，不仅出酒率低，酒质也会变差。

由于白酒的酿造厂区建设时间以及地域位置的差异，不同窖池中酸类物质组成成分和含量有较大差异，某些微生物的组成在优质窖池和普通窖池中的含量差异也很明显.这些差异与酿造质量密切相关，是酿造质控过程需要定量测定的重要因素.其中Lactobacillus acetotolerans的含量在普通窖池和优质窖池之间存在较大差异，需要有特异性很强的方法对该菌进行测定.该菌被发现在多种白酒的发酵过程中在酒醅中都属于绝对优势菌种.但是，乳酸杆菌Lactobacillus这个属目前已知有上百种不同的种，白酒发酵过程中一般涉及近50种不同的乳酸杆菌.而绝大部分乳酸杆菌尚未得到仔细的研究，其基因组信息也很不全面，所以目前针对Lactobacillus acetotolerans的特异性引物设计鲜有报道。

发明内容

本发明通过设计特异性引物，以便可以定量测定Lactobacillus acetotolerans这种重要的工业微生物，通过对Lactobacillus acetotolerans含量的测定判断白酒发酵池窖泥质量的优劣。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术步骤：

一种用于检测白酒发酵过程中耐酸乳酸杆菌含量的两对特异性引物，其特征在于：所述的两对特异性引物包括LA2的正向引物见序列1，LA2的反向引物见序列2；LA3的正向引物见序列3，LA3的反向引物见序列4。

而且，测定酒类腐败菌Lactobacillus acetotolerans含量的步骤如下：

⑴提取样本宏基因组，以基因组为模板，利用上述的两对引物进行扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳实验，根据电泳条带的位置以及明亮程度进行初步判断；

⑵对PCR(Polymerase Chain Reaction)产物进行测序，分析结果，以此来验证并定量衡量上述引物在特定样本中的扩增特异性；

⑶扩增特异性确认后可以使用QPCR对酒类腐败菌Lactobacillus acetotolerans进行定量。

用于检测白酒发酵过程中耐酸乳酸杆菌含量的两对特异性引物用于定量测定酒类腐败菌Lactobacillus acetotolerans含量的应用。

而且，对窖泥和酒醅中该微生物含量的动态变化过程进行测定和跟踪。

用于检测白酒发酵过程中耐酸乳酸杆菌含量的两对特异性引物用于区分优质窖泥和普通窖泥及劣质窖泥的应用。

而且，所述劣质窖泥比优质窖泥中Lactobacillus acetotolerans的含量一般要大于10倍，所述普通窖泥比比优质窖泥中Lactobacillus acetotolerans的含量也要高，但是不高于10倍。

本发明与现有技术相比，具备以下优点和有益效果：