[发明专利]一种高山杜鹃外植体的剥芽消毒方法

说明书

本发明公开一种高山杜鹃外植体的剥芽消毒方法。该方法主要包括：去掉预取芽枝条顶部叶芽、花芽，促进其枝条顶部叶芽、叶柄处侧芽萌发；待枝条在其母株上生长10～30天，顶部叶芽、叶柄处侧芽萌发后，但叶片并未完全展开时，取其叶芽、侧芽进行消毒，在消毒前后各进行一次剥芽处理，即剥去苞片、芽体由外到内的1～2层叶片即为剥芽消毒的外植体。所得剥芽消毒的外植体，其组培污染率不高于30％，芽诱导成活率高于63％，打破了体表密被绒毛和/或腺体的一类高山杜鹃，其植株再生体系建立过程中外植体消毒困难的技术瓶颈，加快了这类高山杜鹃植株再生体系建立的速度，为杜鹃花基础研究、种苗工厂化生产及珍稀濒危种类的保护提供技术支撑。

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及到体表密被绒毛或/和腺体的高山杜鹃外植体的一种消毒方法，可广泛应用于杜鹃花基础研究及种苗工厂化生产中植株再生体系建立的外植体消毒环节。

背景技术

高效植株再生体系的建立是杜鹃花基因工程育种、杂交后代稳定扩繁等基础研究，以及杜鹃花种苗工厂化生产、珍稀濒危种类保育的技术基础。以上应用均要求杜鹃花植株再生体系以营养器官(如芽和茎段)为外植体，以保持繁殖后代与母体遗传性状的一致性。然而，杜鹃花大部分种类的茎及叶片表面密被绒毛或/和腺体，如马缨杜鹃(Rhododendron delavayi)、泡泡叶杜鹃(Rhododendron edgeworthii)、厚叶杜鹃(Rhododendron pachyphyllum)、凸尖杜鹃(Rhododendron sinogrande)、大喇叭杜鹃(Rhododendron excellens)等，致使其植株再生止步于外植体消毒，植株再生体系建立速度缓慢。这类高山杜鹃植株再生体系的建立，常规直接从母株上取下茎尖和茎段作为外植体，75％酒精浸泡30s～1min组合0.1％氯化汞浸泡15～25min或2％次氯酸钠浸泡10～20min组合0.1％氯化汞浸泡15～25min进行外植体消毒，结果要么因消毒不彻底而污染率高(70％～100％)；要么因消毒过度而死亡率高(60％～100％)，甚至外植体死亡了，还会有污染。常需进行多次外植体消毒的尝试才能得到少量无污染的成活外植体。外植体消毒成了体表密被绒毛或/和腺体的高山杜鹃植株再生体系建立的瓶颈。目前，虽然有以马缨杜鹃等种类的茎尖、茎段为外植体诱导植株再生的报道，但具体的外植体污染率和死亡率没有明确结论，消毒效果未知可否。

为解决这一瓶颈问题，我们以茎及叶片密被绒毛或/和腺体的云南野生杜鹃：马缨杜鹃和厚叶杜鹃及栽培品种‘Polaris’为材料，从杜鹃花生长规律出发，通过研究取材时间、枝条预处理、剥芽方法、消毒方法等对降低外植体污染率和死亡率的效果，获得了一种高山杜鹃外植体的剥芽消毒方法。

发明内容

为解决体表密被绒毛或/和腺体的高山杜鹃外植体消毒污染率和死亡率高，阻碍其植株再生体系建立的瓶颈问题，本发明提供一种杜鹃花外植体的剥芽消毒方法。该方法包括以下步骤：

(1)取芽枝条的预处理

4～5月或7～8月，选择生长健壮，侧芽饱满的高山杜鹃枝条，保留其在母株上生长，仅去所选枝条顶部叶芽和/或所选枝条顶部花芽；

(2)取芽及第一次剥芽

待步骤(1)经预处理后的枝条在其母株上生长10～30天，且该枝条顶部叶芽和/或叶柄处侧芽萌发，但叶片未完全展开时，将该枝条上顶部萌发的叶芽和/或叶柄处萌发的侧芽取下，剥去叶芽和/或侧芽的苞片之后，再剥去由外到内的两层叶片得到芽体；

(3)芽体消毒

将芽体，用0.25％洗衣粉水振荡清洗，之后清水漂洗干净芽体表面洗衣粉水后，用2％次氯酸钠溶液浸泡消毒6～8min，再用0.1％氯化汞溶液浸泡消毒8～12min，取出芽体，用无菌水将残留的溶液清洗干净；

(4)第二次剥芽