[发明专利]一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及禽用生物制品技术领域，进一步涉及卵黄抗体制备技术，具体涉及一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法。

背景技术

小鹅瘟(Gosling plague)是由小鹅瘟病毒(Gosling plague virus,GPV)，也称为鹅细小病毒引起的雏鹅急性或亚急性的败血性传染病。本病主要侵害4～20日龄的易感雏鹅，具有传播快、发病率高和致死率高的特点。随着雏鹅日龄增长，其发病率和致死率下降。

比较研究发现，国内不同地区分离株、国内与国外分离株间同源性均较高，无论是结构蛋白还是非结构蛋白，VP3基因核苷酸一致性95％以上；编码基因核苷酸序列一致性均达到92％以上。

雏番鸭细小病毒病是由雏番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)引起的雏番鸭以喘气、腹泻、脚发软及进行性消瘦为主要症状的一种急性、败血性传染病，其特点是传染性强和死亡率高。该病主要发生于3周龄以内的雏番鸭，因此又称雏番鸭“三周病”；发病率和死亡率可达40％以上，是目前番鸭饲养业中危害最严重的传染病之一，严重影响养鸭业的发展。雏番鸭是惟一自然感染发病的动物，发病率和死亡率与日龄关系密切，日龄愈小发病率和死亡率愈高，3周龄以内的雏番鸭发病率为20％～60％，病死率为20％～40％不等。30日龄以上的番鸭也可发病，但发病率和死亡率较低，病鸭往往成为僵鸭。

MDPV在病毒大小、理化特性、形态结构、核酸类型及免疫学特性等方面与鹅细小病毒(即小鹅瘟病毒，GPV)很接近，通过基因比对发现，两种病毒的同源性较高，但两者在致病性上存在较大差异。MDPV只能感染番鸭及番鸭源细胞，而GPV既能感染鹅，又可以感染番鸭及其体外培养细胞。

卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取的针对特定抗原的抗体，由于卵黄中仅有IgG类抗体，因此称其为卵黄免疫球蛋白IgG(yolk antibody)，简称为IgY。

当机体受到外来抗原刺激后，法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体(主要是IgG)在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体，IgG移行进入卵细胞是受体作用的结果，因而IgG可在卵细胞中大量蓄积，浓度高于血液中的IgG，单个卵黄(约15ml)中卵黄抗体含量可达200mg左右。再加之从卵黄中提取抗体较从动物血清中提取抗体简便，因此卵黄抗体具有明显的技术优势。

此外，卵黄抗体在多种环境中有较好的稳定性。在低于75℃条件下，卵黄抗体具有良好的热稳定性，90℃处理15min后，大部分卵黄抗体丧失结合活性，在PH<4时，仅有少量卵黄抗体失去活性。在pH4～12范围内，卵黄抗体的活性几乎不受影响，在pH>12时，卵黄抗体迅速失去结合活性。实验表明，卵黄抗体具有耐受反复冻融的特性，即使经过5次冻融，其抗原结合活性几乎不受影响。在室温下可保存6个月，4℃保存可达5年以上，活性仅下降5％左右。

由于具备上述优越的生物学、理化特性，因此卵黄抗体的制备与应用受到了越来越多的关注。然而现有技术的卵黄抗体普遍为单一抗体类别，仅用于一种疾病的防治，若要获得多联卵黄抗体则需要在免疫环节中对多种抗原同时实现免疫应答，然而这一过程往往难以保证所产多种抗体的效价均处于较高水平。此外，现有技术中卵黄抗体的纯化工艺仍有待完善，常规粗制方法不仅所得产品的抗体效价难以保证，而且可能会污染禽呼肠孤病毒、禽淋巴白血病病毒、网状内皮增生因子、大肠杆菌、沙门氏菌、支原体等外源性致病微生物，从而在使用中造成其他病原的感染和传播。另外，常规的卵黄抗体制备方法难以去除卵黄中的脂蛋白及卵磷脂等大分子物质，因此注射后易发生过敏性反应，同时存在局部组织出血、肿胀、坏死等情况。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，以解决现有技术的卵黄抗体难以同时防治番鸭小鹅瘟和番鸭细小病毒病的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术的卵黄抗体产品对小鹅瘟或番鸭细小病毒病的临床保护效果不佳。

为实现以上技术目的本发明采用以下技术方案：

一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)取小鹅瘟病毒GPV-HB株，制备得到小鹅瘟灭活疫苗；取番鸭细小病毒MDPV-FJ株，制备得到番鸭细小病毒灭活疫苗；购买市售小鹅瘟活疫苗待用；