[发明专利]异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于鱼类细胞生物学领域，尤其涉及一种异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF及其构建方法和应用。

背景技术

真骨鱼类目前是脊椎动物中种类最多的一个类群，确认的物种数目超过了32000个，超过了现存脊椎动物物种数目的一半。早在上个世纪七十年代，Ohno便通过对鱼类染色体和基因组大小关联的一些证据，提出了真核生物中可能存在全基因组加倍的现象(Whole genome duplication)，即基因复制(Gene duplication)的进化理论，认为早期的脊椎动物进化过程中经历了两轮多倍体化过程。随着基因组信息的大量积累，特别是对一些重要的保守线性复制片段 (Duplicates in synteny)的分析表明，脊椎动物这些复制片段发生复制的时间均很集中，这是对 Ohno提出的假说的佐证。脊椎动物中最繁盛的类群真骨鱼类中很可能还发生了第三次多倍化事件，主要的证据也是发现了复制时间相对较集中的基因及基因家族。由于推测多倍体化发生的时间在几百个百万年之前，大部分科学家只能根据保守的复制基因数和基因组大小来推测多倍化发生的可能性，缺乏更直接的证据。因此，能够获得背景清晰的的多倍化体系来研究脊椎动物中的多倍化问题具有重要意义。

20世纪80年代，本研究室以刘筠院士为首的研究团队，打破了鲤鲫杂交鱼雄性完全不育的传统观念，发现红鲫和湘江野鲤杂交F1代中的部分雄性为完全能育型，通过选育，从中获得了世界上第一例两性可育的异源四倍体鱼。20世纪90年代末以来，本研究室科研团队在成功制备了两性可育异源四倍体鲫鲤的基础上，开展了新型及改良多倍体鱼的研制工作。通过雌核发育和雄核发育方法分别建立了雌核发育和雄核发育二倍体鲫鲤克隆体系，并用之制备了在繁殖力、生长速度、抗逆性都得到了提高的改良四倍体鲫鲤。目前该杂交品系已繁殖到F₂₅代(F₂-F₂₅；4n＝200；或者2n＝4x＝200)。

可育异源四倍体鱼不仅可作为进化生物学基础研究上重要的模式动物，而且在生产应用上同样具有重要价值。利用四倍体鱼与二倍体鱼杂交可以实现不育三倍体鱼的大规模制备，不育三倍体生物可将用于繁殖的能量转化到生长能量方面，形成生长快、个体大、肉肥味美、抗逆性强的经济鱼类，对控制养殖鱼类的过度繁殖和保护天然种质资源也具有重要意义。研究室已利用异源四倍体鲫鲤与日本白鲫杂交，获得了生长速度快、抗逆性强、肉质好、不育的水产养殖良种三倍体湘云鲫；利用改良异源四倍体鲫鲤与高背型二倍体红鲫杂交，获得了具有明显改良性状(体背更高、无须、肉质更鲜)的水产养殖良种湘云鲫2号；这些三倍体鱼已在全国28个省市推广养殖，产生了显著的经济和社会效益。

异源四倍体鱼为在体外开展多倍体鱼抗病抗逆研究提供了良好理想的实验材料，但是长期以来，一直缺少合适的在体外研究四倍体鱼免疫学的合适模型。因此建立四倍体鲫鲤体外细胞系不仅实现了首例人工合成多倍体鱼体外细胞系的建立，并且还可以利用该细胞系在体外研究四倍体鱼这一重要模型抗病、抗逆的分子和细胞生物学机制，在多倍体鱼基础研究及应用研究上均具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对目前研究四倍体鱼抗病机制缺乏合适的体外细胞系，而提供一种异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF及其构建方法和应用。

为解决上述问题，本发明提供了一种异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201733。

基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF的构建方法，主要包括以下步骤：

(1)从四倍体鲫鲤尾鳍进行取材，消毒漂洗后剪成尾鳍组织小块；

(2)将步骤(1)后得到的尾鳍组织小块用胎牛血清浸泡后，在DMEM培养基中进行原代培养；

(3)待步骤(2)后得到的细胞生长至形成单层后，加入胰酶进行消化，终止消化后进行传代培养。

上述的构建方法，优选的，所述构建方法具体包括以下步骤：

(1)用浓度为20～30mg/L的高锰酸钾浸泡鱼体10～20min后，再用体积浓度为70％～ 75％的酒精对要取材的四倍体鲫鲤尾鳍进行消毒后，剪取尾鳍组织，用体积浓度为70％～75％的酒精浸泡，再用磷酸缓冲液漂洗后剪成0.5～1mm²的尾鳍组织小块；