[发明专利]一种循环肿瘤细胞的液体活检检测方法

说明书

一种循环肿瘤细胞的液体活检检测方法，它涉及液体活检检测方法，该系统包括富集样本中的循环肿瘤细胞；分离、鉴别出所述循环肿瘤细胞；单位体积内循环肿瘤细胞定量计数。本发明的智能化液体活检方法综合了最新的计算机科学和生物技术，开创性地发明出循环肿瘤细胞定量检测方法、循环肿瘤细胞分离方法，以及循环肿瘤细胞体外培养方法。该方法可实现动态监测肿瘤性状，肿瘤治疗和预后评估，以及肿瘤复发监控等，因此将极大地促进中国个体化精准治疗的发展。

技术领域

本发明属于分子细胞生物学领域，具体涉及一种从人或动物生物体液中富集，鉴定，单位体积定量循环肿瘤细胞的检测方法。

背景技术

循环肿瘤细胞和血液中循环肿瘤DNA(ctDNA)的检测方法统称为液体活检。液体活检具有快速简便、无创性、样本量充足、可连续性监测疾病等优点，因此成为个体化精准治疗研究的一个热点。

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是从实体肿瘤脱落入外周循环血液的具有特殊性状的肿瘤细胞，它与肿瘤的转移复发等有着极为密切的关系，对它的检测有助于肿瘤的临床进展、疗效与预后评估及肿瘤复发监控，具有极其重要的临床意义。近年来的研究对CTC的临床意义已经有了较为清晰的认识。治疗前中后不同阶段CTC检测的临床应用及意义涵盖了从早期诊断，辅助诊断，疗效评估与预后评估，药敏和耐药监测，肿瘤复发监测等各个环节。

CTCs液体活检主要包括循环肿瘤细胞的捕获，鉴别，和后期的计数，捕获细胞基因检测以及捕获活细胞培养，用药指导。特别是动态变化的一系列某一特定病人的CTC计数，可以用来评估该病例的肿瘤负荷，在这一点上与CTC评估肿瘤的大小形成的完美的互补。也可以评估患者对治疗反应，还是判断复发的最佳或者说最敏感的指标之一。

目前，多数CTC检测方法都是以肿瘤细胞表面的上皮细胞标志物为靶点，如上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EPCAM)，用相应的抗体捕获CTC，以细胞表达CKs作为主要诊断依据，这类方法涉及的EPCAM和CKs都具有上皮细胞特异性。目前代表性检测方法是目前唯一通过美国FDA批准进行临床应用的CellSearch系统，该系统虽然进行了有益的尝试，但是其计数的结果并不完全真实，有漏检率很高的问题，受到很多的技术局限。国内cFDA批准的友芝友公司开发的设备，也有CTC计数漏检和操作不便的问题，以叶酸检测为鉴别标准的系统，有临床接受度不高的问题。

近年来大量的科研与临床实验已证明通过去除血中的血缘性有核细胞(如白细胞等)从而达到富集提取血中的非血缘性有核细胞是最为有效的手段。虽然此手段过程中涉及的某些单一方法已经有所报道，如免疫磁珠法去除白细胞，血型糖蛋白-A(glycophorinA)交联法去除红细胞，以及必须借助特殊细胞分离器械的免疫磁性颗粒与密度离心结合的初步尝试等，但这些方法耗时长，白细胞去除率低，靶细胞回收率差，且须使用特殊器材从而带来应用的不便，而且，免疫磁珠无法完全清除白细胞。

荧光原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization，FISH)技术用于病理组织中的肿瘤细胞检测已被临床广泛的接受，有的基因异常和相关的诊断方法步骤，并成为称作临床分子病理诊断的金标准。比如乳腺癌胃癌当中的Her2基因拷贝扩增，肺癌中的ALK基因位置改变等。近年来，也有数项技术应用使用荧光标记的染色体着丝粒特异探针对体液中处于间期的肿瘤细胞进行染色体数目的识别(正常细胞染色体为二倍体)。找到并且计数循环肿瘤细胞。