[发明专利]检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的组合物

说明书

本发明提供了一种用于检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的组合物，所述组合物包括参考品核酸，以及用于检测参考品核酸的引物和探针。本发明还提供了一种用于检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的方法。通过本发明的方法，能够有效准确地检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率，尤其能够帮助发现转化时间不足、转化温度过低、转化试剂过效期等转化过程中可能发生的问题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的组合物，本发明还涉及一种用于检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的方法及其试剂盒。

背景技术

DNA甲基化是表观遗传学的一种调控机制。通过对基因组序列特定区域内CpG碱基组合中的胞嘧啶进行甲基化修饰，生成5-甲基胞嘧啶，DNA胞嘧啶的甲基化修饰在基因表达调控、基因组印记、胚胎发育、维持正常细胞功能以及疾病发生过程中都起着极其重要的表观调控作用。

由于甲基化DNA中的5-甲基胞嘧啶与非甲基化DNA中的胞嘧啶具有相同的碱基配对特性，因此无法直接使用基于碱基配对的技术(例如DNA杂交、PCR等)检测甲基化DNA。因此，当前的DNA甲基化分析中，用于检测甲基化DNA的主要技术都是基于亚硫酸氢盐转化(bisμlfite conversion)，即：亚硫酸氢盐与非甲基化的胞嘧啶发生特异生化反应，经过随后的碱性水解，非甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶；而5-甲基胞嘧啶在相同条件下不发生变化。因此，初始DNA序列中不能区分的胞嘧啶和5-甲基化胞嘧啶，在经亚硫酸氢盐转化之后，能够被基于DNA杂交或PCR的分子生物学技术检测到。

利用亚硫酸氢盐转化检测DNA甲基化的关键是保证亚硫酸氢盐转化为非甲基化的胞嘧啶进行完全，既：保证DNA中非甲基化的胞嘧啶在亚硫酸氢盐处理后，全部或基本全部变为尿嘧啶。胞嘧啶转化不完全会导致后续检测的不准确，导致错误的假阳性加过。在实际检测工作中，由于一方面需要简化流程、缩短检测过程所需时间，另一方面需要保证亚硫酸氢盐转化完全，这对实验流程的可靠性有较高的要求，如：转化时间、转化温度、转化试剂活性等。检测过程中的实验条件的不稳定对亚硫酸氢盐转化有很大的影响。

申请号为CN201610015862.0的发明专利申请公开了一种通过使用核酸标准品浓度梯度和标准曲线绝对定量的方式评估亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的方法。该方法由于使用浓度梯度，需要的检测工作量大；同时，该方法使用SYBER GREEN试剂进行PCR检测，易于受到非特异产物的影响；此外，该方法无法与待测样本在一个PCR体系中进行，因此无法对待检测样本的亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率进行最可靠的评估。

此外，使用焦磷酸测序技术能够直接对亚硫酸氢盐处理后DNA的PCR产物进行测序检测，并对亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率进行测定。但是焦磷酸测序设备昂贵，大多数分子生物学实验室不具备焦磷酸测序设备，而且送检既不方便，也不经济。但是，大多数分子生物学实验室都拥有实时定量PCR仪，因此，基于PCR的亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的测定技术更有实际应用的价值。

因此，当前对检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的简单、可靠地方法存在需求。

发明内容

基于此，本发明的目的是针对在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA这一步骤，提供了一种用于检测亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的组合物，本发明还提供了用于检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的方法及其试剂盒。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的组合物，所述组合物包括至少一种用于检测亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的参考品核酸，和用于检测参考品核酸的引物和探针；

其中，所述参考品核酸的长度为80-120bp，仅包含1-5个胞嘧啶，并且所述胞嘧啶位于长度为1-35bp的第一片段内；