[发明专利]三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201732。

2.一种如权利要求1所述的三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC的构建方法，主要包括以下步骤：

(1)从三倍体湘云鲫尾鳍进行取材，消毒漂洗后剪成尾鳍组织小块；

(2)将步骤(1)后得到的尾鳍组织小块用胎牛血清浸泡后，在DMEM培养基中进行原代培养；

(3)待步骤(2)后得到的细胞生长至形成单层后，加入胰酶进行消化，终止消化后进行传代培养。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体包括以下步骤：

(1)用体积浓度为70％～75％的酒精对要取材的三倍体湘云鲫尾鳍进行消毒后，剪取尾鳍组织，用70％～75％的酒精浸泡，再用磷酸缓冲液漂洗后剪成0.5～1mm²的尾鳍组织小块；

(2)将步骤(1)后得到的尾鳍组织小块用磷酸缓冲液清洗，进行离心，去上清，再用磷酸缓冲液重复清洗，加入尾鳍组织小块5～10倍体积的胎牛血清浸泡15～30min，进行离心，去上清后，将得到的尾鳍组织小块均匀接种于培养皿底部，25℃下倒置干贴0.5～2h，往培养皿中加入DMEM培养基，置于25℃且含体积5％CO₂的培养箱中培养；

(3)当细胞生长至形成单层后，去除培养皿中的培养基并加入磷酸缓冲液润洗细胞，去除磷酸缓冲液，加入质量浓度0.25％的胰酶消化，除去胰酶，加入DMEM培养基终止消化，用移液器轻轻吸打使细胞充分分离，以1：1.5～2的细胞数量比进行传代，然后仍置于培养箱中继续培养，待其再次长至单层后，依照上述方法再进行传代培养，将得到的三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC进行细胞冻存和细胞复苏。

4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，所述三倍体湘云鲫为3～9月龄的改良三倍体湘云鲫。

5.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中的DMEM培养基，其中还包括青霉素、链霉素、人碱性成纤维细胞生长因子和胎牛血清，使青霉素的浓度为100Iμ/mL，链霉素的浓度为100μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/mL，胎牛血清的体积占总体积的15％～30％。

6.根据权利要求5所述所述的构建方法，其特征在于，所述胎牛血清所占的比例根据培养细胞所处的代数来调整，第一代到第十代细胞用含有体积30％胎牛血清的DMEM培养基培养，第十一代到第三十代细胞培用含有体积20％胎牛血清的DMEM培养基培养，第三十一代后的细胞用含有体积15％胎牛血清的DMEM培养基中培养。

7.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，浸泡时间为10～40s，漂洗遍数为2～3遍；

所述步骤(2)中，离心使用的转速为800～1000rpm，离心时间为3～5min，磷酸缓冲液重复清洗1～2次，定期更换培养基的方式是每隔4～6天更换培养皿中一半的培养基；

所述步骤(3)中，消化时间为1～2min。

8.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述细胞冻存的具体步骤为：选取生长旺盛且细胞密度达到90％以上的一皿细胞，去除培养皿中的培养基并加入磷酸缓冲液润洗细胞，去除磷酸缓冲液，加入质量浓度0.25％的胰酶消化1～2min，除去胰酶，加入含有体积15～30％胎牛血清的新鲜DMEM终止消化，用移液器轻轻吸打使细胞充分分离，然后将细胞移入冻存管中，以转速为800～1000rpm离心3～5min，去上清，用冻存液悬浮细胞，将冻存管置于冻存盒中，4℃条件下放置1～2h，然后移至-20℃条件下放置1～2h，再将其放到-80℃条件下放置12～24h，最后移至液氮罐中保存；所述冻存液中含体积20％的胎牛血清、10％二甲基亚砜和70％DMEM。

9.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述细胞复苏的具体步骤为：从液氮罐中取出保存的冻存管，将其管盖朝上置于25℃水中融化，细胞完全融化后用移液器将其轻轻混匀，并转入盛有培养基的培养皿中，放置于25℃的培养箱中培养。

10.一种如权利要求1所述或由权利要求2～9中任一项所述构建方法得到的三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC在多倍体鱼类抗病毒免疫研发领域的应用。