[发明专利]一种蜘蛛毒素杀虫肽

说明书

技术领域

本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及昆虫电压门控钠通道抑制剂,杀虫肽可作为农业害虫防治的应用。

背景技术

农业害虫严重破坏了粮食供应，并传播了各种各样的人类和动物病原体。虽然化学杀虫剂是防治害虫的主要手段，但目前很多害虫产生严重的抗药性，导致有些害虫再猖獗。同时农药残留对环境和人类健康产生了很大影响。因此，我们迫切需要开发新的、安全的、更为高效并对环境无害的新型杀虫剂。

发明内容

本发明的目的旨在于提供一种以昆虫离子通道为靶点并具备选择性的杀虫肽。

上述发明目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供的杀虫肽来自于白额高脚蛛(Heteropoda venatoria)的蜘蛛粗毒，通过分离纯化而得到的一种具有37个氨基酸残基的多肽；由37个氨基酸残基组成，含6个半胱氨酸形成的3对二硫键，分子量为4169.63Da，等电点4.27，氨基酸序列为：氨基酸序列为Asp Asp Asp Cys Gly Lys Leu Phe Ala Asp Cys Thr Ser Asp Ser Asp Cys Cys Glu Asn Trp Val Cys Ser Lys Thr Gly Phe Val Lys Asn Ile Cys Lys Tyr Asn Phe。

杀虫肽对属于昆虫纲蜚蠊目的美洲蜚蠊具备较强致死活性。另外，具备较低的哺乳动物毒性，是进行农业害虫防治的潜在分子。在高效防治农业害虫的同时，使用多肽类杀虫剂可以避免传统化学杀虫剂对人类和环境的危害。

白额高脚蛛杀虫肽的分离纯化和制备方法

（1）杀虫肽分离纯化

白额高脚蛛用电刺激（5-10V 的脉冲电流）3-5s的方法采集毒液，于-70℃下冷冻干燥成白色粉末，再于-20℃低温存放。10 mg的粗毒干粉用10 ml双蒸水溶解后，12000转/分钟离心五分钟，取上清液进行用C18 RP-HPLC进行初步分离纯化（图1A）（大连依利特P230p制备型HPLC；反相制备柱：月旭，Ultimate XB-C18，5μm，4.6mm´250mm；洗脱液分别为：A液(0.1%TFA/H₂O)、B液（0.1%TFA/ACN）；洗脱梯度， 5-60 min, 5-60% B液； 流速，3 ml/min；温度，25°C），在215 nm下监测多肽的洗脱，收集星号洗脱峰，冻干。对星号洗脱峰进一步细分（图1B）（美国Waters HPLC 2795；反相分析柱：月旭，Ultimate XB-C18, 5 μm，4.6 mm´250 mm；洗脱液分别为：A液（0.1%TFA/H2O）、B液（0.1%TFA/ACN）；洗脱梯度， 12-38 min, 20-50% B液；流速：1 ml/min；温度：25°C），在215nm下监测多肽的洗脱，收集星号洗脱峰，冻干，并用质谱测定其分子量。使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱MADI-TOF MS（AB SCIEX，美国）鉴定其分子量为45168.12 Da(图1E)。使用自动Edman降解和cDNA文库数据库得到它的氨基酸序列为Asp Asp Asp Cys Gly Lys Leu Phe Ala Asp Cys Thr Ser Asp Ser Asp Cys Cys Glu Asn Trp Val Cys Ser Lys Thr Gly Phe Val Lys Asn Ile Cys Lys Tyr Asn Phe，包含六个半胱氨酸，是典型的ICK（抑制性半胱酸结）模体结构。

（2）杀虫肽的化学合成