[发明专利]一种快速建立基因敲除细胞株的重组载体及其方法

说明书

本发明公开了一种快速建立基因敲除细胞株的重组载体及其方法，载体包括目的基因切割载体、Donor载体和Donor载体的切割载体；然后将以上三种载体共转染目标细胞，转染后48h分别采用药物筛选或流式细胞分选快速富集基因修饰阳性细胞。最后，通过有限稀释法或单克隆挑取获得基因敲除细胞株。该方法采用双筛选标记，具有基因敲除效率高，筛选周期短，获得基因敲除细胞株快的优点，最大限度的缩短了获得基因敲除细胞株的时间，在基因功能研究领域具有重要意义。

技术领域

本发明涉及分子生物学及遗传学前沿技术领域，具体为一种快速建立基因敲除细胞株的重组载体及其方法。

背景技术

近年来，随着基因工程技术的发展，由TALEN技术、CRISPR/Cas9技术引领的针对特定基因、特定位点的精确修饰为人类解码基因功能、探索疾病致病机制提供可靠的技术手段。特别是随着CRISPR/Cas9系统的发现及工程化，使其成为当前基因工程领域功能最为强大的基因修饰工具。与传统的ES细胞基因打靶或敲除相比，基于CRISPR/Cas9系统的基因修饰技术，包括基因定点突变、基因敲除和外源基因定点插入等，表现出更具高效、快捷和广泛的应用前景。

CRISPR/Cas9系统针对模式动物受精卵基因组的修饰，使其在短短几年内创造出数以千计的基因工程大鼠和小鼠。但是，在细胞基因修饰方面，由于很难针对单个细胞进行基因修饰并使其扩增建立细胞群，所以唯一可行的方案是针对细胞群进行基因修饰，然后从细胞群中筛选获得基因修饰阳性细胞并建立细胞株。由于进行处理的细胞众多，很难确定哪个细胞为阳性细胞，所以传统的做法是通过大量的单细胞分离培养，使其形成单克隆细胞群，然后进行大量的细胞基因型鉴定。这样的基因敲除细胞株的建立过程费时，费力，获得基因敲除细胞株比较困难。因此，为了满足对不同细胞、不同基因功能的研究，建立一种高效、快速的基因敲除阳性细胞的富集和筛选方法成为当前基因工程领域亟待解决的问题。

发明内容

针对传统基因敲除细胞制作方法的局限，为了使基因敲除细胞株的构建更加高效、快捷，借助CRISPR/Cas9系统，本发明提供了一种快速建立基因敲除细胞株的重组载体及其方法。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案包括：

一种快速建立基因敲除细胞株的重组载体，包括目的基因切割载体、Donor载体和Donor载体的切割载体，其中：

目的基因切割载体为带有针对目的基因设计的gRNA的gRNA/Cas9表达载体；

Donor载体为带有针对目的基因种属相异的非同源基因序列设计的gRNA/Cas9靶序列的EGFP和抗性基因表达载体；

Donor载体的切割载体为带有针对目的基因种属相异的非同源基因序列设计的gRNA的gRNA/Cas9表达载体。

具体的，所述的针对目的基因种属相异的非同源基因序列设计的gRNA/Cas9靶序列为GTGAACGTCTCCTAAAGCGTGTGG碱基序列。

更具体的，所述的gRNA/Cas9表达载体可以为pX330载体，EGFP和抗性基因表达载体可以为pIRER2-EGFP载体。

详细的，所述的目的基因切割载体为在gRNA/Cas9表达载体的U6启动子下游带有针对目的基因设计的gRNA的载体；

所述的Donor载体为在EGFP和抗性基因表达载体Ndel酶切位点与多克隆位点之间带有针对目的基因种属相异的非同源基因序列设计的gRNA/Cas9靶序列的载体；

Donor载体的切割载体为在gRNA/Cas9表达载体U6启动子下游带有针对目的基因种属相异的非同源基因序列设计的gRNA的载体。

还有，所述的针对目的基因设计的gRNA为针对目的基因的第一外显子DNA序列或第二外显子DNA序列设计的gRNA。