[发明专利]木聚糖酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法、及饲料的制备方法

说明书

本发明公开一种木聚糖酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法、及饲料的制备方法，其中，所述木聚糖酶基因Xynsyn2用于编码木聚糖酶，所述木聚糖酶基因Xynsyn2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的木聚糖酶基因Xynsyn2，采用了毕赤酵母中的高频密码子替换原有的低频密码子，降低了mRNA的自由能及其mRNA二级结构的复杂性，消除了基因中富含AT或GC的区域以及木聚糖酶中的蛋白酶作用位点，从而显著提高了人工合成的木聚糖酶基因Xynsyn2在毕赤酵母细胞中的表达量，提高了木聚糖酶的酶活力。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种木聚糖酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法、及饲料的制备方法。

背景技术

现有的饲料一般以玉米、小麦、麸皮或稻谷等作为主要原料，其中含有较多的非淀粉性多糖(包括阿拉伯木聚糖、葡聚糖、果胶以及纤维素等)，但是由于非反刍类动物体内缺少降解纤维素的酶，使其无法消化半纤维素而容易形成糜状积食，影响动物肠道微生物的种群类型，从而影响对饲料的吸收。在饲料中添加合适的木聚糖酶可以破碎植物细胞壁并水解半纤维素，从而达到降低食糜粘度的目的，提高饲料的利用率。

在工业生产中制备饲料的过程中，其工艺温度较高，因此需要木聚糖酶在高温条件下仍具有活性。但是现有的木聚糖酶的制备方法，一种是通过PCR 技术从相关产木聚糖酶的微生物中扩增出木聚糖基因，连接到表达载体中，再导入相关表达宿主来表达木聚糖酶，制备出来的木聚糖酶的最适温度比较低、最适pH偏中性且蛋白的表达量小，工业应用限制较大；另一种是从自然界产木聚糖酶的微生物中筛选菌株，然后对菌株进行改良或者对发酵工艺尽心优化，制备出来的木聚糖酶的酶活和表达量均不高、且最适温度较低，在工业生产中容易失活。

毕赤酵母真核表达系统是目前广泛使用的真核生物表达系统，具有生物安全性好、遗传元件稳定、高密度发酵工艺成熟、表达水平高以及目的蛋白分离纯化简便等优点，是异源蛋白中工业化生产的理想宿主。然而，由于受到毕赤酵母对异源基因密码子使用偏好性、mRNA二级结构的复杂性、基因中富含A/T或G/C区段、蛋白酶切割位点以及基因在宿主中的丰度等因素影响，异源基因在毕赤酵母中难以获得高效表达。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种木聚糖酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法、及饲料的制备方法，旨在提高木聚糖酶基因在木聚糖酶中的表达量。

为实现上述目的，本发明提出一种木聚糖酶基因Xynsyn2，用于编码木聚糖酶，所述木聚糖酶基因Xynsyn2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提出一种木聚糖酶，所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO： 2所示。

本发明还提出一种重组表达载体，包括如上述的木聚糖酶基因Xynsyn2。

优选地，所述木聚糖酶基因Xynsyn2的拷贝数为多个。

本发明还提出一种重组表达菌株，包括如上述的木聚糖酶基因Xynsyn2。

优选地，所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。

本发明还提出一种如上述的重组表达载体的制备方法，包括如下步骤：

将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2通过酶切位点EcoRⅠ连接到中间载体 pUC57，获得pUC-Xynsyn2载体；

将pUC-Xynsyn2载体和pAO815载体分别用EcoRⅠ酶切，电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段；

将木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段通过T4DNA连接酶连接，获得pAO815-Xynsyn2重组表达载体。

本发明还提出一种如上述的重组表达菌株的制备方法，包括如下步骤：