[发明专利]细胞冻存液和细胞冻存方法

说明书

本发明提供了一种细胞冻存液和细胞冻存方法，涉及细胞技术领域，本发明提供的细胞冻存液，成分包括甲基纤维素、糖类、氨基酸和DMSO。本发明提供的细胞冻存液，不含有胎牛血清成分，从而彻底杜绝了过敏反应，以及一些动物病毒的污染引入；同时，降低了DMSO的含量，从而降低了冻存液的毒性对细胞的影响。另外，本发明提供的细胞冻存方法，利用梯度降温，提高冻存后细胞复苏的活率。经过实验验证，在细胞形态、增值率、诱导分化潜能等细胞主要考察内容，本发明提供的冻存液与冻存方法均优于传统冻存液及传统冻存方法。

技术领域

本发明涉及细胞技术领域，尤其是涉及一种细胞冻存液和细胞冻存方法。

背景技术

间充质干细胞来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，这意味着其在临床治疗和再生医学领域的应用前景十分广阔。

间充质干细胞的应用，对细胞数量需求较大，而其直接获取量较小，所以须在获取后进行体外扩增培养。而细胞扩增培养到一定数量后会失去部分功能特性，所以，为了保证细胞的有效性和一致性，体外培养进行到一定阶段时，必须进行低温保存(液氮，-196℃)。

在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成冰晶，能导致细胞内发生一系列的变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白质变性等，能引起细胞死亡。向冻存液中加入保护剂(一般为DMSO),可使冰点降低，在缓慢的冻存条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。

降温的速度与冻存效果直接相关，降温速度不同，细胞内水分向细胞外流动的情况也会不同。如果降温速度过慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，同时细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生结冰；降温速度过快，细胞内水分没有足够时间外渗，随着温度的下降，细胞内会发生结冰；如果降温速度非常快，细胞内形成的冰晶反而非常小或不结冰而呈玻璃状凝固(玻璃化冷冻)。不同的降温速度也会使细胞内外产生不同的生理变化，同样也可能对细胞造成损伤。降温速度过慢，细胞严重脱水，体积急剧收缩，超过一定程度时细胞失去活性。降温速度过慢会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶液损伤。降温速度过快，细胞内水分来不及外渗，会在胞内形成较大冰晶，造成细胞膜和细胞器的损伤，产生细胞内冰晶损伤。

冻存保护剂可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。冻存保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成。同时冻存保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。冻存保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内。该类保护剂主要包括DMSO、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时。细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定时间进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。非渗透性冷冻保护剂一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内。该类保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等。其保护机制的假设很多，其中一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量。使冰点降低。减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。

目前，最常用的冻存液通常为胎牛血清中添加10％二甲基亚砜(DMSO)，也有一些冻存液选用间充质干细胞培养基替代部分胎牛血清。使用胎牛血清容易引入疯牛病及其他病毒感染，异种生物制品还可能诱发过敏反应；此外，浓度较高的DMSO具有一定的生物毒性，会降低细胞活率，诱导干细胞分化。这意味着，目前普遍使用的两种物质都不是冻存液的最佳选择。