[发明专利]一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物活性物质提取技术领域，具体是一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法。

背景技术

在鳕鱼产品加工过程中，会产生大量废弃物，如鱼骨、鱼头、鱼皮等，约占原料总量的40～55%，如果不对废弃物进行有效加工利用，这样不仅仅会污染环境，还造成资源的浪费。废弃物中鳕鱼皮约占下脚料的7～8%，这些下脚料只有少数充当动物的饲料，大部分都被浪费，随意丢弃，造成经济价值低下。

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease， NAFLD)是以肝细胞脂肪变性和脂肪堆积为主要特征的病理综合征，脂肪代谢受雌激素、生长激素、皮质醇、胰高血糖素、胰岛素等激素调节的影响，这些激素可以短时间内迅速使许多蛋白质和糖类等其他物质经新陈代谢转变成脂类物质堆积在人体，而肝脏无法完全排除这些多余的脂肪，进而导致脂肪肝的形成。目前治疗的方法主要采取减肥治疗、降脂治疗和血管紧张素转换酶抑制剂等保守治疗，但保守治疗目前尚缺乏特效方法，效果欠佳。资料显示，NAFLD不单纯是肝脏疾病，而是肥胖，高脂血症，胰岛素抵抗等代谢综合征相关组分在肝脏的集中体现，其中胰岛素抵抗和遗传易感性与其发病密切相关，近年来，随着生活水平的提高及饮食结构的改变，NAFLD在我国己成为仅次于病毒性肝炎的第二大慢性肝病，但其发病机制尚未完全阐明，治疗上也缺乏有效措施，因此，建立稳定可靠的便于进行药物干预实验的NAFLD模型成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作步骤简单、鳕鱼皮胶原蛋白肽提取率高、提取的鳕鱼皮胶原蛋白肽纯度高，对非酒精性脂肪肝模型具有明显的修复作用且性质稳定的鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，包括预处理、酶解和超滤。预处理：先将鱼皮清洗干净，在2~8℃蒸馏水中浸泡10~30min，接着用6~12倍体积的0.08~0.12mol/L氢氧化钠溶液浸泡4~8h，然后用清水洗涤至中性。 沥干水分，用0.08~0.12mol/L冰乙酸溶胀9~15h，粉碎得到鳕鱼鱼皮粉末。氢氧化钠溶液中加入0.0002~0.0005mol/LN-乙酰-D-谷氨酰胺和0.0001~0.0002mol/LN-乙酰-L-谷氨酰胺。上述碱处理可去除鱼皮肌原纤维，使鱼皮软化，破坏其中非胶原成分的作用、去除杂蛋白。上述预处理可去除大部分重金属离子，使得制得的胶原蛋白肽的灰分、盐分含量很低，羟脯氨酸占总氨基酸的比例高。碱液中加入微量的N-乙酰-D-谷氨酰胺和N-乙酰-L-谷氨酰胺，可明显增加酶解产物中氨基氮含量，并对制得的鳕鱼皮胶原蛋白的空间结构具有一定的影响，但具体机理尚不明确。

酶解：在鳕鱼鱼皮粉末中加入蒸馏水和碱性蛋白酶酶解，酶解结束后灭酶，离心取上清液。碱性蛋白酶对鳕鱼皮胶原蛋白的微观结构（包括折叠和薄片大小、胶原网络连接性和表面积大小）有一定的改变，并且胶原蛋白肽链间发生交联，形成特定的分子结构。本发明酶解得到的分子量1~2KDa以下鳕鱼皮胶原蛋白肽可明显降低非酒精性脂肪肝模型（NAFLD）血清中ALT、AST活性，对NAFLD有优良的修复作用。

酶解条件为料液比1:1.5~4，温度42~55℃，pH8.5~9.5，时间8~12h，加酶量1500 ~2500U/g。上述酶解条件为最优选，底物浓度过高，会导致溶液黏稠度增大且流动性降低、减少了酶中心与底物的接触。底物浓度过低，会增大超滤及冷冻干燥时的工作量，造成资源的浪费。酶解时间过长会导致胶原蛋白分解，进而影响其提取率。

超滤：依次采用8~10KDa、5~8KDa、3~5KDa、1~3KDa、1KDa以下的超滤膜对酶解液进行超滤，取分子量1KDa以下部分，纳滤去盐后冷冻干燥。为了防止膜孔堵塞或膜损害，先采用大孔超滤膜进行超滤，再采用小孔超滤膜超滤，有效去除分子量大于1kDa的杂质。纳滤可较彻底的去除溶液中的无机盐及分子量小于200Da的杂质，对鳕鱼皮胶原蛋白肽进一步进行纯化。

冷冻干燥时加入15~25wt%聚乙烯吡洛烷酮和0.5~0.9%十四烷酸。鳕鱼皮胶原蛋白肽需要含有合适的剩余水分来保持在储存过程中性质的稳定，过度的干燥将使胶原蛋白肽分子表面的氢键和极性基团暴露而变性。冷冻干燥过程中，加入聚乙烯吡洛烷酮和微量十四烷酸，可保护胶原蛋白肽的蛋白伸展、四级结构，从而对胶原蛋白肽活性进行保护。

与现有技术相比，本发明的优点在于：